特發性肺間質纖維化以肺泡上皮細胞凋亡（apoptosis）導致肺泡結構完整性破壞和肺成纖維細胞增生為特征。早期各種炎癥細胞和肺泡細胞分泌炎癥因子引起細胞損傷與細胞增殖失控，啟動細胞凋亡的途徑，引起肺纖維化。Bcl-2和Bax是一對相互拮抗的基因產物，兩者自可形成同二聚體，也可相互作用為異二聚體。Bcl-2和Bax與凋亡調控直接相關：Bax增高促進細胞凋亡；Bcl-2增高抑制細胞凋亡。兩者的平衡狀態維持肺組織細胞的正常，保持呼吸功能的穩定。

　　1 器材

　　1.1 藥物防治藥物：復方鱉甲軟肝方(內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產的復方中藥干粉，600 g/瓶，批號：20020501)，高劑量1.4 g·kg-1·d-1、中劑量0.7 g·kg-1·d-1、低劑量藥物為0.35 g·kg-1·d-1，相當于臨床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。

　　陽性對照藥：醋酸強的松0.56 mg·100 g-1·d-1，廣東華南制藥廠生產，批號011201。

　　造模藥物：注射用鹽酸博萊霉素(bleomycin，BLM-A5 )，日本化藥株式會社生產，批號X12100。

　　1.2 動物及分組SD大鼠180只，雄性，體重200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物級別：SPF/VAF，許可證編號：SCXK2002-0003。飼養于同級動物房，自由飲水。購入后適應性飼養1周，進行實驗分組。動物隨機分為6組：假手術組；模型組；陽性藥物對照組；復方鱉甲軟肝方（以下表格中簡稱鱉甲方組）高、中、低劑量組。每組30只。各組均于7，14，28 d隨機抽取10只大鼠采血，同時取肺制成光、電鏡標本。

　　1.3 試劑凋亡試劑購于北京中杉金橋生物技術有限公司分裝的Sigma公司試劑。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-Bax， SC-1666 Mouse anti-PAR4 SC-7382 Mouse anti-BCL-2。

　　1.4 儀器

　　石蠟切片機，萊卡2016、包埋機，KD-BM。低溫冰箱MDFU5410(-60℃)成都泰盟科技有限公司，數碼顯微照相機Nikon Coolpi×4500。

　　2 方法

　　2.1 大鼠肺纖維化模型制備用1.5%戊巴比妥鈉（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，頸部剪去毛、常規碘酒與酒精消毒，切開頸正中皮膚，逐層分離，暴露氣管，然后用一次性1 ml注射器向氣管內注入0.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 ml·kg-1），然后立即將動物直立并旋轉，使藥液在肺內均勻分布。假手術組大鼠肺部注入等體積的生理鹽水。

　　2.2 取材和切片制備

　　2.2.1 各組光鏡取材常規取材。事先用APES處理切片，37℃ 24～48 h溫箱干燥備用。石蠟切片，厚度為5 μm。脫蠟后組織片裱于APES處理后的載玻片上（免疫組化染色），入37℃溫箱干燥48 h備用。

　　2.2.2 各組電鏡取材常規普通電鏡取材。

　　2.3 免疫組化操作步驟（Bcl-2，Bax）將切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟15 min→100%酒精Ⅰ15 min，100%酒精Ⅱ15 min，95%酒精10 min→90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水沖洗→0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min→蒸餾水洗兩次，2 min/次 ，PBS洗5 min→0.1mol/L枸櫞酸緩沖液內微波爐抗原修復（溫度98～100℃）20 min→室溫自然冷卻后加10%山羊血清，37℃濕盒內室溫孵育30 min→傾去血清，不洗，加一抗，鼠抗PARP(1∶100),鼠抗Bax和Bcl-2（1∶100），濕盒內4℃過夜。取出濕盒室溫放置30 min，37℃放置1 h→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→濕盒內滴加生物素化二抗（抗鼠1∶100）→0.01mol/L PBS洗3次，5 min/次→滴加辣根酶標記的鏈酶卵白素工作液，濕盒內37℃孵育30 min→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→DAB顯色（1 ml蒸餾水中加入DAB、緩沖液及H2O2各一滴，混勻），顯微鏡下控制顯色程度→水充分沖洗以中止顯色→梯度酒精脫水：70%酒精30Sec，80%酒精1 min，90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各30 min，二甲苯各透明20 min→中性塑膠封固→陰性對照用0.01 mol/L PBS 代替一抗，其余步驟同上。

　　2.4 結果

　　判定在用DAB顯色的免疫細胞化學切片上，陽性反應按顏色深淺分為：棕黃色為強陽性；黃色為陽性；淺黃色為弱陽性；與間質顏色一致者為陰性。

    3 結果

　　3.1 電鏡下細胞凋亡結果電鏡下可見Ⅱ型細胞核膜表面凹凸不平，染色體邊集，電子密度增強，固縮現象明顯。胞質內凋亡小體中可見膜包裹完整的細胞核碎片。Ⅰ型細胞細胞器和胞質濃縮，細胞膜破壞，核染色質的凝集邊界不清。

　　3.2 Bax和Bcl-2在肺組織中表達免疫組化結果

　　3.2.1 Bcl-2在肺組織中免疫組化結果7 d時Bcl-2在假手術組肺組織中細胞質、細胞核中均無表達，只在肺間隔Ⅱ型細胞的核膜部分表達；復方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組在肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞部分細胞質呈淺黃染色，呈現陽性表達，偶見肺巨噬細胞核著色（棕色）呈強陽性表達。假手術組在28 d時仍然呈肺間隔Ⅱ型細胞的核膜部分表達，其意義有待進一步探討。模型組肺泡間隔細胞及巨嗜細胞胞質內見分布均勻的棕色顆粒，明顯多于假手術組和藥物組。且絕大多數已進入胞核，而復方組的Bcl-2的陽性表達則偏重于胞質。

　　3.2.2 Bax在肺組織中免疫組化結果實驗結果表明，Bax在肺組織中主要在肺泡Ⅰ型、部分Ⅱ型細胞和肺泡腔炎癥細胞的胞質部位呈陽性表達，部分在肺泡隔間質細胞表達。7 d時假手術組和高、中劑量藥物組在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細胞、肺泡炎癥細胞和部分間質細胞的胞質中呈陽性表達，尤其Ⅰ型細胞中表達較多，部分間質細胞的胞核也有表達。在模型組、陽性藥物組、低劑量組在肺間隔肺泡Ⅰ型細胞有部分表達，在巨噬細胞胞漿呈陽性表達結果。14 d假手術組和高、中、低劑量組在肺泡間隔細胞質均呈現弱陽性表達。陽性藥物組和模型組表達較弱。28 d假手術組和高、中、低劑量組肺泡間隔表達較好，呈陽性，但不如7 d表達明顯。肺泡Ⅰ型上皮細胞也有部分表達。

　　4 討論

    復方鱉甲軟肝方通過調節細胞中Bax和Bcl-2的凋亡蛋白表達，抑制成纖維細胞增生，抑制細胞因子，調節AT-II的凋亡，保持上皮細胞完整性，從而達到抗纖維化的作用。

TAG：復方鱉甲軟肝片