【摘要】  目的 研究白癜風黑素細胞超微結果和小眼畸形相關轉錄因子（MITF）及其轉錄調控的酪氨酸酶相關蛋白（TRP）與白癜風臨床類型與病程的相關性。方法  選擇不同病程的尋常型白癜風（VV）12例和節段型白癜風（SV）8例，分別取白斑區、白斑邊緣正常膚色區和遠離白斑正常膚色區的表皮片，經組織學確定其表皮的完整性。透射電鏡觀察10例患者（VV 6例，SV 4例）不同區表皮黑素細胞的超微結構特點。對所有20例遠離白斑正常膚色區的表皮片黑素細胞進行培養，應用免疫印跡方法檢測MITF及其轉錄調控的酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYPR1）和酪氨酸酶相關蛋白2（TYRP2）的表達水平。結果  白癜風表皮黑素細胞超微結構病理改變：10例中7例白斑區表皮內未見黑素細胞，1例短病程和2例長病程VV分別可見少量黑素體顯著減少或缺失的黑素細胞；白斑邊緣正常膚色區，6例VV中，3例病程小于15個月者可見黑素細胞超微結構異常，而4例SV中僅1例異常；遠離白斑正常膚色區，10例黑素細胞超微結構均正常。白癜風表皮黑素細胞MITF及其轉錄調控TRP的表達：VV的MITF表達下調與TYR、TYRP1、TYRP2的表達下調一致；SV存在MITF顯著表達下調，而TYR、TYRP1、TYRP2幾均正常表達。 結論  VV和SV可能存在不同的表皮黑素細胞超微結構病理改變和MITF轉錄調控機制。

 【關鍵詞】 白癜風；黑素細胞；黑色素小體；小眼畸形相關轉錄因子

 

白癜風是一種難治性皮膚色素脫失性疾病，根據臨床特征分為尋常型白癜風（VV）和節段型白癜風（SV）。目前認為VV的發病與免疫或氧化應激造成表皮黑素細胞損傷有關，而SV則可能與遺傳缺陷有關，研究VV和SV不同的黑素細胞缺陷機制，對于選擇相應的治療方法具有重要的指導意義。人類皮膚黑素生成過程中，有酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）和酪氨酸酶相關蛋白2（TYRP2）等構成的酪氨酸酶相關蛋白（TYR）發揮著核心作用，并受作為黑素細胞標志的小眼畸形相關轉錄因子（MITF）的轉錄調控。本研究首先對具有不同病程的VV和SV患者的白斑區、白斑邊緣區以及遠離白斑的正常膚色區皮膚進行超微結構研究，并對來源于遠離白斑的正常膚色區的表皮片黑素細胞進行培養，分析MITF及其轉錄調控的TYR、TYRP1和TYRP2的表達。

 

病例與方法

一、             病例

1. 病例與標本：選擇我院白癜風專病門診確診病例20例，男9例，女11例，年齡16~35歲，病程平均為26個月（3~300個月），其中VV12例，SV 8例。所有病例均在白斑區、白斑邊緣正常膚色區、遠離白斑的腹部或臀部的正常膚色區進行負壓吸皰各2~6枚，吸皰壓力約為40kPa，吸皰時間40~100min均為完全起皰。所有皮片均行常規組織學檢查，對遠離白斑正常膚色區表皮片進行黑素細胞培養，選擇其中6例VV和4例SV行透射電鏡檢查。另取我科表皮囊腫手術切除的4例正常人皮膚組織作為對照。本研究獲得我院倫理委員會批準，同時所有患者均知情同意。

2.試劑：F12基礎培養基、胎牛血清、谷氨酰胺、慶大霉素、0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05%胰酶-EDTA、D-Hanks液、基因素均購自美國Gibco公司，人重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購自美國Pepro—Tech公司，MITF（Ab12039）、TYR（Ab52493）、TYRP1（Ab3312）和TYRP2（Ab74073）均為英國Abcom公司產品，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原抗體均為美國Santa Cruz公司產品。

 

二、方法

1.表皮完整性的確定：所有皮片均經蘇木素-伊紅（HE）染色，針對層黏連蛋白和Ⅳ型膠原的免疫組化檢查，確定表皮的完整性。

 

2.透射電鏡觀察：觀察10例（VV 6例，SV 4例）不同區表皮黑素細胞的超微結果特點。表皮片以3%戊二醛固定，按透視電鏡常規制作超薄切片，于電鏡下觀察、拍照。

 

3.表皮片黑素細胞培養：所有20例遠離白斑正常膚色區的表皮片黑素細胞進行培養。取遠離白斑正常膚色區表皮片4枚浸入無菌D-Hanks液中并漂洗2次，分別以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA于37℃孵育10min，將細胞懸液加入10%含血清的F12培養基吹打5次，1000 r/min 離心5 min，用黑素細胞Hu16選擇性培養（F12基礎培養基，含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清）吹打成細胞懸液，調整細胞濃度為5×10⁵/ml，接種于培養瓶中，37℃、5%CO²培養箱內培養，3 d后加入基因素以去除角質形成細胞和纖維細胞，隔日換液1次，經2~5次傳代后黑素細胞融合達80%時，以0.05%胰酶-EDTA消化黑素細胞，離心收集于F12培養基中備用。

 

4.免疫印跡：按照分子克隆操作手冊，常規進行細胞總蛋白提取并定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），免疫印跡（濕轉），免疫顯色。各抗體工作濃度：MITF、TYR、TYRP1均為1:500，TYRP2為1:200，GAPDH和二抗均為1:5000。

 

5.統計分析：應用Band Scanner生物醫學軟件，記錄并分析MITF、TYR、TYRP1、TYRP2與內參照GAPDH的灰度值比。應用F檢驗進行方差齊性檢驗，根據方差齊性結果，選擇兩組間t檢驗或t’檢驗，比較MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的蛋白表達差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

 

結果

一、白癜風表皮黑素細胞超微結構的特點

①正常膚色區：和正常人所見相同，均可見正常細胞器和黑素體結構，為較多呈卵圓形的黑素化較完全的Ⅲ、Ⅳ期黑素體及少量不完全黑素化的Ⅰ期和Ⅱ期黑素體。②白斑邊緣區：4例SV中僅1例存在黑素細胞內質網腫脹，核周空泡形成；而6例VV中，3例病程短于15個月者可見正常黑素體形成障礙和黑素體聚集現象，粗面內質網腫脹，黑素細胞核周圍水腫或形成空泡結構。③白斑區：7例黑素細胞完全消失，1例病程為3個月的VV白斑區中殘留的黑素細胞可見明顯的黑素體減少和和核周空泡形成，2例病程超過10年的VV可見少量黑素體結構完全消失的黑素細胞。

 

二、白癜風黑素細胞MITF及其轉錄調控分子TYR、TYRP1、TYRP2的表達情況

12例VV和8例SV表皮的黑素細胞MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的相對表達情況見表1.

表1 黑素細胞MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的相對表達情況（ ±s）

組別	例數	MITF	TYP	TYRP1	TYRP2
白癜風組
尋常組	12	0.82±0.17	0.80±0.19	0.61±0.17	0.34±0.16a
節段組	8	0.59±0.26a	0.86±0.10	0.72±0.06	0.42±0.15
正常對照組	4	0.92±0.29	0.88±0.04	0.71±0.03	0.50±0.02

與正常對照組比較，VV組TYRP2的表達下調，SV組的MITF表達下調。12例VV中，2例MITF、TYR、TYRP1、TYRP2均同時有表達下調，另外3例僅有TYRP2表達下調；8例SV中，5例存在MITF表達下調，而TYR和TYRP1均表達正常，僅1例存在TYRP2表達下調不一致，提示SV的黑素生成障礙可能不依賴于MITF的轉錄調控。

 

討論

黑素體是黑素合成的惟一場所，是一種類似于溶酶體的細胞器，包括酶成分和結構成分，黑素體外形結構與形成黑素的類型相關，其中優黑素呈卵圓形，含纖維性基質，跟證據黑素化程度分為Ⅰ~Ⅳ期。黑素細胞的細胞器粗面內織網（RER）、轉運高爾基體網絡（TGN）、TRP是黑素（體）形成的物質基礎。

 

既往對白癜風黑素細胞超微結構觀察發現：白癜風白斑區表皮內幾無黑素細胞，但是有作者發現部分白癜風皮損中仍然殘留黑素細胞，只是其不具有合成黑素的功能；活動期白癜風多見的白斑周圍正常膚色區存在黑素細胞超微結構病理的改變，也可見于穩定期白癜風的白斑周圍正常膚色區，主要表現為黑素體形成與轉運障礙，以及與黑素形成密切相關的粗面內織網和高爾基體的結構異常；體外培養的白癜風正常膚色區的黑素細胞同樣存在類似的超微結構病理改變。我們的研究表明：白癜風白斑區表皮內無黑素細胞，但長病程者仍存在少量無黑素生成活性的黑素細胞；白斑周圍正常膚色區的黑素細胞超微結構病理改變與病程長短和白癜風臨床類型密切相關：黑素細胞超微結構在SV和長病程（穩定期）VV正常，而短病程（進展期）VV異常；遠離白斑區的正常膚色區，無論其臨床類型和病程長短，黑素細胞超微結構及黑溯溪生成功能均正常。

 

人類皮膚黑素生成由超過90余個位點、150余個等位基因、200多種分子共同組成了有序、立體的調控網絡，其中，TYR為黑素生成，為優黑素生成的速度調節器。作為黑素細胞的標志，MITF構筑的轉錄調控網絡在黑素細胞的發育、分化和功能等方面發揮著重要的作用。MITF基因突變可導致人類Waardenburg綜合征2型和小鼠白癜風，但有學者證實，MITF基因突變與人類白癜風無關。由于患有b-HLH-ZIP結構的MITF轉錄調控與黑素生成密切相關的TYR、TYRP1和TYRP2等重要分子，因此，MITF功能抑制與白癜風相關。本研究通過遠離白斑的正常膚色區表皮黑素細胞培養后發現，VV黑素細胞存在部分MITF表達下調與TYR、TYRP1和TYRP2的表達下調一致，提示VV黑素生成抑制于MITF的轉錄調控密切相關；而SV黑素細胞盡管存在顯著的MITF表達下調，但TYR和TYRP1均正常表達，提示SV的黑素生成存在不依賴于MITF的轉錄調控。另外，VV存在TYRP2顯著表達下降現象，而我們在另外的研究中還發現了MITF對TYRP2的負調控現象（待發表），提示TYRP2的功能可能并不局限于黑素生成的速度調節器。

 

很多皮膚疾病可根據皮損分布特點分為節段型與非節段型（尋常型），兩者可能存在不同的發病機制。本研究結果表明，VV和SV存在不同的黑素細胞超微結構病理改變及MITF轉錄調控，我們還需要進一步證實VV和SV可能存在的不同發病機制.

 

參考文獻:王平,洪為松,章莉,洪健,鄭俊惠,徐愛娥,白癜風表皮黑素細胞超微結構及小眼畸形相關轉錄因子轉錄調控研究[J]中華皮膚科雜志2010年7月第43卷第7期

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