Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in hepatitis B virus

　　Jie Yan, Wen Xie, Lei Wang, Jing-Bo Wang, Xin Feng, Shu-Jing Song, Shun-Ai Liu, Hong-Shan Wei

　　Jie Yan, Wen Xie, Xin Feng, Shu-Jing Song, Shun-Ai Liu, Hong-Shan Wei, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China

　　Lei Wang, Jing-Bo Wang, Ji’nan Hospital of Infectious Diseases, Medical College of Shandong University, Ji’nan 250021, Shandong Province, China

　　Supported by the Capital Medical Science Foundation, No. 2002-3046

　　Correspondence to: Jie Yan, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China. jieyan@bbn.cn

　　Received: 2006-03-06 Accepted: 2006-03-16

　　Abstract

　　AIM: To establish a simple, accurate and practical method for the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation (rtA181V mutation) in hepatitis B virus.

　　METHODS: Four shares of serum were collected from patients who had been treated with adefovir dipivoxil for more than 1 year, and HBV DNA replication reoccurred. Two pairs of primers were designed to amplify the region of HBV reverse transcriptase codon 181(rt181) in order to introduce a BlpI restriction site upon PCR product of wild type (wt). After amplification, the PCR products were digested with BlpI and then subjected to electrophoresis. The patterns of rtA181V mutation were detected by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.

　　RESULTS: Of the 4 patients, rtA181V mutation was detected in 2 cases by the above method. The established nest PCR-RFLP assay could detect HBV DNA at the level of 103 copies/L. The result of RFLP analysis was in accordance with that of DNA sequencing.

　　CONCLUSION: The ntPCR–RFLP assay is a rapid, simple, specific and sensitive method for the detection of rtA181V mutation in HBV.

　　Key Words: Adefovir dipivoxil; Hepatitis B virus; Mutation

　　Yan J, Xie W, Wang L, Wang JB, Feng X, Song SJ, Liu SA, Wei HS. Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in hepatitis B virus. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2006;14(7):714-717

　　摘要

　　目的:  建立一種簡便、快速、實用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韋(ADV)耐藥變異—rtA181V變異的快速檢測方法.

　　方法:根據GenBank收錄的HBV基因全序設計巢式PCR引物, 使野生株(rt181  A)PCR產物中含有BlpⅠ酶切位點(5,GCTNAGC3), 而變異株(rt181V)無此限制性酶切位點. 選取4份應用ADV治療1 a以上出現HBV DNA反跳的臨床耐藥慢性乙型肝炎患者血清，經PCR擴增、BlpⅠ酶切、30 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 進行限制性片段長度多態性(RFLP)分析. 并選擇經該方法鑒定的野生株及變異株各一例進行HBV  RT區基因序列分析及對照質粒的構建.

　　結果:自4份血清標本中檢測到2例rtA181V變異. 所建立的ntPCR-RFLP方法靈敏度高, 可以檢測到103  copies/L的HBV DNA; 特異性強, 其RFLP分析結果與DNA測序結果一致.

　　結論:應用ntPCR-RFLP方法檢測rtA181V變異具有靈敏、特異、簡便的優點,  適用于ADV耐藥變異的臨床監測工作.

　　 

　　關鍵詞: 阿德福韋; 肝炎病毒; 乙型; 變異

　　0 引言

　　抗乙型肝炎病毒(HBV)新藥-阿德福韋酯(adefovir dipivoxil, ADV)已經國家食品藥品管理局(SFDA)批準在我國上市. 臨床研究表明ADV能有效地抑制HBV DNA復制, 使HBV DNA滴度迅速降低, 而且在出現拉米夫定(lamivudine)耐藥的患者中ADV能繼續有效地抑制變異株[1-3]. 但隨著ADV的長期應用, 目前已發現該藥亦存在耐藥現象; 現已得到學術界公認的耐藥株有兩種: rtN236T變異和rtA181V變異[4-5]. 此前我們已建立了基于巢式聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態技術(ntPCR-RFLP assay)的rtN236T變異快速檢測方法[6].  進一步應用該技術建立用于rtA181V變異的快速檢測方法, 以期對ADV耐藥變異進行更為全面的監測.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 4份慢性乙型肝炎(CHB)血清取自北京地壇醫院及濟南傳染病醫院就診患者. 4患者均應用ADV治療1 a以上, 治療過程中曾出現HBV DNA陰轉, 此后再次出現HBV DNA反跳.

　　1.2 方法 胃采用異硫氰酸胍一步法提取血清中的DNA.待檢血清50 mL加入含4 mol/L異硫氰酸胍的裂解液60 mL，37℃溫育10 min; g離心10 min; 取上清, 加入等量異丙醇, -20℃沉淀2 h, 13 000 加入酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)50 mL, 震蕩混勻后13 000 mL/L 乙醇50 mL, 13 000 g離心10 min, 棄上清, 室溫干燥后加入雙蒸水20 mL溶解, g離心10 min, 棄上清; 加入600 -20℃保存.

　　rtA181V變異是由于HBV基因組第671堿基由胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(T), 從而導致HBV聚合酶B區rt181氨基酸由丙氨酸(alanine, A)變異為纈氨酸(valine, V)(圖1). 故而以此為基礎, 檢索GenBank收錄的HBV基因全序, 采用Primer Premier 5.0及Oligo 6.67軟件輔助分析, 設計巢式PCR引物(外引物: P1、P2, 內引物: rt181up, rt181low); 旨在使野生株(rt181 A)PCR產物中含有BlpⅠ酶切位點(5, GCTNAGC3, ), 而變異株(rt181V)無此限制性酶切位點(圖1, 表1).

　　圖1PCR-RFLP檢測rtA181V變異的設計. 

　　表1 PCR引物序列 

　　mL 以血清提取物為模板進行巢式PCR反應: 30 PCR反應體系含Taq酶1 U, 10×擴增緩沖液3 mL，25 mol/L dNTP 0. 12 mL、50 mmol/L引物0.12 mL; mL, 引物為P1, P2; 第二輪PCR模板為第一輪PCR產物3 mL, 引物為rt181up, rt181low. 第一輪PCR模板為血清提取物6 s, 53℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共 30循環, 72℃ 7 min. 兩輪PCR循環條件均為94℃ 3 min, 94℃ 10 取第二輪PCR產物8 mL, 以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, EB染色后于紫外燈下觀察結果, 于331 bp處出現熒光條帶者為陽性.

　　BlpⅠ酶切: 10 mL酶切反應體系內含第二輪PCR產物8 mL, BlpⅠ10 U, 酶切緩沖液1 mL, 于37℃酶切4 h. 將全部酶切產物以30 g/L瓊脂糖凝膠電泳, EB染色后于紫外燈下觀察結果. PCR產物經酶切后野生株較變異株缺失21 bp, 故電泳速度稍快.

　　對照質粒的構建: 同時采用PCR產物直接測序方法對經該方法鑒定的野生株及變異株進行HBV RT區基因序列分析(方法見參考文獻[7], 序列測定由上海生工生物工程技術服務公司完成); 并將上述PCR產物純化后與T-載體(美國Promega公司)連接, 構建重組質粒, 轉化JM109菌, 經雙脫氧末端終止法進行測序鑒定后用作對照質粒.

　　2 結果

　　以不同HBV DNA濃度的血清提取物為模板進行PCR檢測, 終檢濃度為103 copies/L(HBV DNA熒光定量試劑盒購自深圳匹基生物技術公司), 表明該巢式PCR反應具有良好的靈敏度. 陽性標本PCR產物大小與預期值相符(331 bp), 表明該巢式PCR反應具有高度特異性.RFLP分析: BlpⅠ酶切后電泳結果顯示, 4份血清標本中有2份被完全酶切, 為野生株(rt181A); 尚有2份未被酶切, 為變異株(rt181V)(圖2). HBV RT區基因序列測定結果與RFLP分析結果一致(圖3), 并將2條變異株RT區基因序列提交至GenBank, 其序列號(accession number)分別為: DQ343155、DQ343156.

　　圖2 BlpⅠ酶切產物電泳結果. M: 變異型對照質粒; W: 野生型對照質粒; 1-4: 血清標本.

　　圖3HBV RT區基因序列測定結果. A: 野生型對照質粒(nt:GCT, aa: A); B:  變異型對照質粒(nt: GGT, aa: V).

　　3 討論

　　隨著ADV臨床應用時間的延長, 與之相關的HBV耐藥變異發生率亦逐年增多, 并且該類耐藥變異的出現可能會導致嚴重的肝臟失代償[8]. 我國HBV慢性感染患者眾多, 在ADV廣泛應用之前應建立完善的耐藥監測體系以指導臨床合理用藥[9], 為此亟待建立一種簡便、快速的ADV耐藥變異檢測方法. 目前得到學術界公認的耐藥株有兩種: rtN236T變異和rtA181V變異[4-5], 此前我們已建立了基于巢式聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態技術(ntPCR-RFLP assay)的rtN236T變異快速檢測方法[6]; 為了能夠對ADV耐藥變異進行更為全面的監測, 進一步應用該技術建立用于rtA181V變異的快速檢測方法.

　　在技術路線方面, 仍采用用于檢測rtN236T變異的ntPCR-RFLP技術和30 g/L瓊脂糖凝膠電泳; 是因為基于上述技術的拉米夫定耐藥變異檢測方法已為國內眾多實驗室廣泛應用, 具有靈敏、特異、簡便、實用之優點[10-13], 故而采用該技術便于在國內推廣, 建立全國性的完善的ADV耐藥監測體系.

　　目前已有兩種品牌的阿德福韋酯在我國上市, 隨著用藥時間的延長, 已有部分患者出現HBV DNA反跳, 甚至臨床癥狀的加重. 我們應用ntPCR-RFLP技術檢測4例服用ADV 1 a以上出現臨床耐藥的患者血清中HBV變異情況, 發現2例rtA181V變異和1例rtN236T(將于另文報道); 可見對ADV耐藥變異進行臨床監測確系刻不容緩.  

　　4 參考文獻

　　1 Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, Chang TT, Kitis G, Rizzetto M, Marcellin P, Lim SG, Goodman Z, Wulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart CL. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen-negative chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003; 348: 800-807 PubMed

　　2 Marcellin P, Chang TT, Lim SG, Tong MJ, Sievert W, Shiffman ML, Jeffers L, Goodman Z, Wulfsohn MS, Xiong S, Fry J, Brosgart CL. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2003; 348: 808-816 PubMed

　　3 Schiff ER, Lai CL, Hadziyannis S, Neuhaus P, Terrault N, Colombo M, Tillmann HL, Samuel D, Zeuzem S, Lilly L, Rendina M, Villeneuve JP, Lama N, James C, Wulfsohn MS, Namini H, Westland C, Xiong S, Choy GS, Van Doren S, Fry J, Brosgart CL. Adefovir dipivoxil therapy for lamivudine-resistant hepatitis B in pre- and post-liver transplantation patients. Hepatology 2003; 38: 1419-1427 PubMed

　　4 Angus P, Vaughan R, Xiong S, Yang H, Delaney W, Gibbs C, Brosgart C, Colledge D, Edwards R, Ayres A, Bartholomeusz A, Locarnini S. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003; 125: 292-297 PubMed

　　5 Villeneuve JP, Durantel D, Durantel S, Westland C, Xiong S, Brosgart CL, Gibbs CS, Parvaz P, Werle B, Trepo C, Zoulim F. Selection of a hepatitis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation patient. J Hepatol 2003; 39: 1085-1089 PubMed

　　6 閆杰, 馮鑫, 王磊, 宋淑靜, 謝雯, 歐蔚妮, 李蘊銣. ntPCR-RFLP檢測HBV阿德福韋耐藥變異-rtN236T變異. 世界華人消化雜志 2005; 13: 543-545

　　7 閆杰, 馮鑫, 王磊, 宋淑靜, 謝雯, 李蘊銣.拉米夫定治療中病毒核酸無應答患者體內乙型肝炎病毒逆轉錄酶基因變異分析. 世界華人消化雜志 2005; 13: 130-132

　　8 Fung SK, Andreone P, Han SH, Rajender Reddy K, Regev A, Keeffe EB, Hussain M, Cursaro C, Richtmyer P, Marrero JA, Lok AS. Adefovir-resistant hepatitis B can be associated with viral rebound and hepatic decompensation. J Hepatol 2005; 43: 937-943 PubMed

　　9 茅益民, 曾民德. 抗乙型病毒性肝炎新藥-阿德福韋酯. 中華肝臟病雜志 2004; 12: 61-63

　　10 封波, 魏來, 陳明, 李秀華. 包含YMDD基因序列的乙型肝炎病毒P區基因變異的研究. 中華肝臟病雜志 2004; 12: 29-31

　　11 丁靜娟, 張偉三, 張莉莎. 乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因變異檢測方法研究. 中華實驗和臨床病毒學雜志 2004; 18: 24-27

　　12 趙平, 李捍衛, 樓敏, 程勇前, 蘭云, 福軍亮. 拉米夫定耐藥的慢性乙肝患者聯合干擾素或苦參素治療療效觀察. 中華實驗和臨床病毒學雜志 2004; 18: 80-82

　　13 劉艷, 胡毅文, 樂曉華, 王召欽, 袁靜, 林奕, 駱子義, 蔣小玲. 拉米夫定治療慢性乙型肝炎1-3年隨訪結果. 中華傳染病雜志 2004; 22: 204-206

TAG：乙肝 阿德福韋酯