唐紅

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　　乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。雖然乙肝疫苗的成功應(yīng)用使新發(fā)HBV感染有所下降，但目前HBV慢性感染者仍有3.5億人之多。由于HBV感染的致病和致癌變機(jī)理并不完全清楚，故目前尚缺乏特效的治療手段。

HBV屬嗜肝DNA病毒，通過逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制復(fù)制。HBV基因組的轉(zhuǎn)錄是病毒復(fù)制過程中最關(guān)鍵的步驟，并受到精細(xì)的調(diào)控。因此，了解HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控機(jī)理，將有助于進(jìn)一步澄清乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理，并可為抗病毒治療提供可能的作用靶點(diǎn)，這對發(fā)展治療HBV感染的有效方法具有十分重要的意義。

 

一、HBV基因轉(zhuǎn)錄與病毒復(fù)制

　　HBV基因組全長3.2kb，具有四個(gè)啟動(dòng)子和兩個(gè)增強(qiáng)子（EnhⅡ/Cp、PS1p、Sp和EnhⅠ/Xp），分別調(diào)控3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb HBV mRNA的轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)而編碼合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBxAg，且3.5kb前基因組RNA（pregenomic RNA）也是病毒逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制的模板。

　　HBV的生活周期涉及病毒進(jìn)入細(xì)胞，HBV DNA進(jìn)入胞核形成cccDNA，HBV RNA轉(zhuǎn)錄，HBV DNA復(fù)制，HBV病毒的包裝、成熟和排泌等過程。HBV進(jìn)入肝細(xì)胞后脫去核殼，HBV基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核。首先，以負(fù)鏈DNA為模板延長正鏈并修補(bǔ)，封閉正鏈中的裂隙，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。然后，以cccDNA為模板，在宿主RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄生成上述幾種不同長短的RNA。其中，除編碼合成HBcAg、HBeAg和DNA多聚酶外，3.5kb前基因組RNA還具有一個(gè)重要功能，即作為病毒逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制的模板。在病毒復(fù)制過程中，HBV DNA多聚酶結(jié)合于3.5kb前基因組mRNA 5’端ε莖–環(huán)結(jié)構(gòu)，形成RNA/多聚酶復(fù)合物，并被核心抗原多肽二聚體包裹成未成熟的核殼體。在核殼體內(nèi)的HBV DNA多聚酶催化下，以3.5kb前基因組RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈HBV DNA，然后再以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈HBV DNA。最終形成子代的不完全雙鏈環(huán)狀DNA。因此，HBV基因組（尤其是3.5kb前基因組）RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是病毒生活周期中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

 

二、HBV基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

　　HBV基因轉(zhuǎn)錄受多種泛嗜和肝富集轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，也與病毒蛋白產(chǎn)物（如HBx）的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。利用含HBV啟動(dòng)子的報(bào)導(dǎo)基因體系，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一系列對HBV啟動(dòng)子具調(diào)控作用的順式調(diào)控序列和反式調(diào)控因子，可以通過調(diào)控HBV基因轉(zhuǎn)錄，從而影響病毒的復(fù)制。

3.5kb前基因組RNA的水平主要受存在于HBV基因組EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp區(qū)域的順式調(diào)節(jié)序列的調(diào)控。HBV EnhⅠ/Xp中現(xiàn)已證實(shí)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在于核苷酸1000至1250位的區(qū)域，該區(qū)域位于HBV 3.5kb RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游550-800位核苷酸處；能與EnhⅠ/Xp結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子包括C/EBP、P53、IRF、NF1、HNF3、HNF4、RXR、PPAR、COUPTF、RFX1、AP1、CREB和ATF2等。已發(fā)現(xiàn)的能與HBV Cp結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子有SP1、RFX1、C/EBP、FTF、HLF、E4BP4、HNF4、HNF3、RXR、PPAR、COUPTF1和ARP1等，其結(jié)合位點(diǎn)位于HBV前CRNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游（-180至-16）的區(qū)域。

　　在HBV RNA轉(zhuǎn)錄物中，3.5kb前基因組RNA是病毒DNA合成的模板，而病毒蛋白產(chǎn)物的水平則與各種HBV DNA轉(zhuǎn)錄物的水平相關(guān)。因此，HBV基因組的轉(zhuǎn)錄是病毒生物合成的主要調(diào)控步驟。研究顯示，若干種肝富集轉(zhuǎn)錄因子（如HNF1、HNF3、HNF4、RXRα、PPARα、HLR、FTF和C/EBP等）能與HBV的四個(gè)啟動(dòng)子結(jié)合，對HBV的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要調(diào)控作用。其中，位于EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp啟動(dòng)子的HNF4結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)也是RXR/PPAR的結(jié)合位點(diǎn)，是調(diào)控C啟動(dòng)子活性及3.5kb mRNA轉(zhuǎn)錄的重要因子，在HBV高度組織特異性表達(dá)中可能具重要作用。而泛嗜轉(zhuǎn)錄因子如AP1、RFX1、NF1和SP1等對決定HBV啟動(dòng)子活性和HBV轉(zhuǎn)錄水平也具重要的協(xié)同調(diào)節(jié)作用。

 

三、HBV基因轉(zhuǎn)錄對病毒復(fù)制的影響

　　在DNA病毒中，HBV具有非常獨(dú)特的復(fù)制機(jī)制，即其基因組首先要被轉(zhuǎn)變成RNA，然后再通過逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行復(fù)制。病毒復(fù)制涉及3.5kb前基因組RNA（pgRNA）的合成、PgRNA包裝形成核殼體和逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA等多個(gè)步驟。因此，HBV的復(fù)制涉及基因轉(zhuǎn)錄和基因轉(zhuǎn)錄后雙重水平，以及多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控作用。其中，由宿主RNA多聚酶Ⅱ催化合成前基因組RNA是HBV復(fù)制的起始步驟，并受HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性的影響。下面重點(diǎn)對我們近年來有關(guān)肝富集轉(zhuǎn)錄因子和HBx在HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制中的調(diào)控作用作一介紹：

 

1、肝富集轉(zhuǎn)錄因子在HBV嗜肝機(jī)理中的作用：

　　HBV感染的一個(gè)顯著特點(diǎn)是嗜肝性，闡明的HBV的嗜肝機(jī)理對乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理及防治機(jī)理研究均具重要意義。我們應(yīng)用于2001年建立的全新的HBV非肝源細(xì)胞復(fù)制體系的研究顯示，肝富集轉(zhuǎn)錄因子在HBV的肝特異性復(fù)制表達(dá)過程中起重要作用。其中，核激素受體HNF4和RXRα/PPARα通過與HBV基因組C啟動(dòng)子結(jié)合而促使病毒前基因組RNA的合成，并支持HBV在非肝源細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，為HBV前基因組RNA合成和病毒復(fù)制所必需，是病毒嗜肝性的重要決定因素之一。而肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF3對核激素受體介導(dǎo)的HBV復(fù)制具抑制作用。提示HBV復(fù)制不僅取決于HNF4和RXRα/PPARα的水平，也與HNF3的相對水平和活性密切相關(guān)。從而揭示HBV的嗜肝機(jī)理涉及HBV感染進(jìn)入細(xì)胞和HBV基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制兩個(gè)水平的調(diào)控。

 

2、肝富集轉(zhuǎn)錄因子在病毒突變株篩選中的可能作用：

　　臨床上，部份乙肝患者雖發(fā)生血清HBeAg/抗-HBe轉(zhuǎn)換，但HBV DNA仍然陽性，這類病人通常伴有HBV前C區(qū)變異株的出現(xiàn)。一般認(rèn)為，前C RNA和HBeAg合成減少所致的“免疫逃逸”是前C區(qū)變異株出現(xiàn)的重要原因。發(fā)生于HBV C啟動(dòng)子A1764T和G1766A的核苷酸替代（稱TA變異）的變異株是臨床最常見的變異之一，該變異正好位于C啟動(dòng)子遠(yuǎn)端核激素受體結(jié)合位點(diǎn)中。利用肝癌和非肝癌HBV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)我們發(fā)現(xiàn)，HNF4和RXRα/PPARα對野生株和該變異株HBV病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制具有不同的調(diào)節(jié)作用，改變HNF4和RXRα/PPARα的相對水平可能會(huì)選擇變異株的產(chǎn)生，提示肝富集轉(zhuǎn)錄因子對HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的調(diào)控與抗病毒免疫過程中病毒變異株的產(chǎn)生相關(guān)。

 

3、HBV X蛋白可能通過調(diào)控HBV基因轉(zhuǎn)錄而影響HBV復(fù)制：

　　HBV X蛋白（HBx）是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)蛋白，對基因轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等均具調(diào)節(jié)作用。HBx可能通過這些作用直接或間接調(diào)控HBV復(fù)制，并可能導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變。利用HBV體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究顯示，HBx對HBV復(fù)制具有增強(qiáng)作用。既往多數(shù)研究認(rèn)為，HBx對HBV復(fù)制的增強(qiáng)是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制，如通過激活Ca2+離子通路或調(diào)節(jié)蛋白酶體活性而影響核殼體的形成和穩(wěn)定性等。我們最近的研究顯示，HBx不僅增強(qiáng)HBV DNA復(fù)制，而且對3.5kb HBV RNA的轉(zhuǎn)錄也具激活作用，且對RNA轉(zhuǎn)錄的激活與DNA的增強(qiáng)作用密切相關(guān)。提示HBx對HBV的增強(qiáng)作用涉及HBV基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的雙重調(diào)節(jié)。

 

　　近年研究還顯示，許多免疫調(diào)節(jié)因子（如干擾素）也有可能通過調(diào)節(jié)HBV基因轉(zhuǎn)錄而影響HBV復(fù)制。此外，近年在HBV基因組中也發(fā)現(xiàn)了一些能夠影響HBV負(fù)鏈和正鏈合成的新的順式調(diào)節(jié)序列。

 

　　總之，HBV基因轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制受多個(gè)層面、多種因素的調(diào)控和影響，近年的研究雖然取得了較大進(jìn)展，但許多環(huán)節(jié)尚未完全明暸，值得進(jìn)一步研究。對HBV基因轉(zhuǎn)錄與復(fù)制調(diào)控機(jī)理的深入研究，將有可能為抗HBV藥物的研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。