乙型肝炎病毒感染會導致急慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，其攜帶者較非攜帶者發生肝癌的相對危險率為217[1]。目前，我國人群中HBV的感染率高達57.6%，其中約1.2億為慢性HBV攜帶者，占我國人口的9.8%左右[2]。而臨床上較為有效的藥物IFN-a，其近期療效中血清HBeAg和HBV DNA陰轉率僅為40%左右，且由于一定的副作用及價格昂貴而使臨床應用受限[3]。因此，尋找有效并適合我國國情的抗HBV藥物十分必要。研究表明，氧化苦參堿臨床治療慢性乙型肝炎顯示了較好的近期療效[4]，擔對其藥理機制遠不夠了解。為此，我們用HepG2-2.2.15細胞為模型，觀察氧化苦參堿體外抗HBV活性，并對其作用機理作初步探討。

材料與方法

一、 藥物：

　　苦參素注射液（含氧化苦參堿98%，規格200mg/2ml），寧夏綠谷藥業有限公司產品。批號：寧衛藥準字（1994）第000029號。IFN-a 2b（商品名：隆化諾，300萬單位/支），上海華新生物高技術有限公司產品。批號：（97）衛藥試字（蘇新寶）S-02號。

二、 細胞培養：

　　HepG2-2.2.15細胞經美國The Mount Sinai Medical Center的Acs教授同意,由衛生部分子病毒重點實驗室聞玉梅教授惠贈。用含20%小牛血清、0.03%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素、380μg/ml G418的DMEM液，置于37°C、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。

三、 藥物對HepG2-2.2.15細胞的毒性試驗：

　　通過細胞形態學觀察，了解藥物引起的細胞毒性作用，根據Mosmann等建立的MTT比色分析法[5]判定各孔中存活細胞增殖代謝情況及細胞毒性反應。

四、 藥物應用：

　　培養細胞用胰蛋白酶消化成單個細胞接種于6孔培養板（4x104細胞/孔），加入培養液4ml，于5%CO2培養箱中37°C培養48小時后換入不同濃度含藥培養液，同時設不含藥物對照組；每3天換新鮮含藥培養液共4次，換出的細胞上清液-20°C保存待檢，并收集細胞提取核心顆粒HBV DNA。

五、 上清液中HBsAg、HBeAg的檢測：
　　
　　采用微粒酶免疫（MEIA）測定技術（美國ABBOTT公司）檢測。
　　抑制率=（對照組S/N值-藥物組S/N值）/對照組S/N值x100%。

六、 細胞內核心顆粒HBV DNA的提取及定量檢測：

　　參照文獻方法[6]：6孔板干預細胞以PBS洗滌兩次，用細胞裂解液（10mM Tris-HCl pH7.9；1mM EDTA；1% NP-40；50mM NaCl；8% 蔗糖）將細胞轉移至Eppendorf管中，離心后保留上清，加DNase I、RNase A37°C孵育15分鐘后，以EDTA、PEG8000沉淀核心顆粒。然后重懸沉淀，加裂解液（25mM Tris-HCl pH7.5；10mM EDTA；0.1M NaCl；0.5% SDS；1mg/ml 蛋白酶K）孵育過夜后，酚：氯仿：異戊醇抽提，1/10體積3M NaAc和2倍體積冷無水乙醇沉淀DNA，干燥后溶于50ml雙蒸水中。應用bDNA信號擴增試驗（QUANTIPLEXTM HBV DNA Assay,CHIRON公司）定量檢測HBV DNA滴度。最低檢測限度為0.7 HBV DNA MEq/ml。

　　測定值以均數±標準差（X±SD）表示。采用SAS軟件包的Dunnett￠s T檢驗進行統計分析，p值<0.05為差異有顯著性。

結 果

一、氧化苦參堿的細胞毒性試驗：

　　我們檢測了藥物對2.2.15細胞的毒性作用以消除存活細胞減少引起的HBV DNA水平下降的可能性。結果顯示氧化苦參堿在2000mg/ml濃度下，細胞形態學和MTT比色A值比較，實驗組和對照組間無明顯差異，提示在該濃度范圍內其對2.2.15細胞生長無毒性作用。IFN-α 2b在5x104IU/ ml濃度以下未見明顯細胞毒性。

二、 氧化苦參堿對HBsAg、HBeAg的抑制效果：

　　根據藥物的細胞毒性試驗結果初步確定了用藥濃度范圍。從表1可見，氧化苦參堿對2.2.15細胞分泌的HBsAg、HBeAg均有抑制作用，并且隨著藥物濃度增加，抑制率逐漸增高。氧化苦參堿在2000mg/ml時對HBsAg、HBeAg的抑制率分別達到40.57%、48.27%。在同一濃度下，都表現為對HBeAg的抑制率高于對HBsAg的抑制率。

三、 氧化苦參堿對HBV DNA的抑制效果：

　　　　　　　　　　　　表1氧化苦參堿對2.2.15細胞(2x106細胞)HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制效果

藥物 濃度 HBsAg抑制率（%） HBeAg抑制率（%） HBV DNA(MEq/ml)
空白對照組  0 0 136.50±6.20
氧化苦參堿(mg/ml) 10 4.05 9.22 134.79±5.45
50  9.92 26.01 128.42±0.45
100  14.19 29.25 83.46±3.12*
500 19.08 33.87 57.16±2.35*
1000  33.02 43.07 38.94±1.16*
2000 40.57 48.27 34.02±0.36*

*與空白對照組比較,P<0.05

　　如表1所示，氧化苦參堿濃度為100～2000 ug/ml時，能明顯降低2.2.15細胞胞漿核心顆粒HBV DNA水平（P<0.05），并隨著濃度增加，其對HBV DNA的抑制作用亦增強。

四、 IFN-α2b的抗HBV效果

　　　　　　　　　　　　表2 IFN-α2b對2.2.15細胞(2x106細胞)HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制效果

藥物 濃度 HBsAg抑制率（%） HBeAg抑制率（%） HBV DNA(MEq/ml)
空白對照組  0 0 136.50±6.20
IFN-α 2b（IU/ml） 10 4.77 25.75 134.09±0.14
1x102 12.25 33.36 2.79±0.77*
1x103 28.84 37.48 17.75±2.01*
1x104 38.20 51.80 13.75±1.60*
5x104 42.91 58.68 6.19±0.94*

*與空白對照組比較,P<0.05

　　如表2所示，IFN-α 2b對HBsAg、HBeAg和合成和分泌及2.2.15細胞胞漿核心顆粒HBV DNA有明顯的抑制作用。

討論

　　HepG2-2.2.15細胞株是通過將克隆雙體HBV DNA及抗G418抗性質粒共轉染人肝癌細胞系HepG2細胞而建立的[7]，能長期穩定地向培養上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，并能產生大量的病毒復制中間體。雖然用HBV DNA轉染細胞與HBV自然感染存在一定的距離，無法反映由于治療所激活的肝細胞外效應因子如細胞毒T淋巴細胞、HBV特異性抗體的作用，但是仍然不失為體外抗-HBV藥物篩選很好的細胞模型。HBsAg、HBeAg為分泌至2.2.15細胞培養上清液中的可溶性蛋白質，間接地反映了病毒復制狀況；2.2.15細胞胞漿核心顆粒是HBV的復制復合體[8]，核心顆粒HBV DNA是病毒感染復制最靈敏、最直接的指標,反映了細胞內非整合的復制性HBV DNA的變化情況。為此,本研究觀察2.2.15細胞內核心顆粒HBV DNA及分泌的HBV抗原的變化，以判斷氧化苦參堿的療效，同時結合病毒復制周期，大致推斷其作用機理。

　　本研究結果發現,氧化苦參堿可明顯降低2.2.15細胞胞漿核心顆粒HBV DNA的水平，提示其能抑制HBV DNA的復制。同時氧化苦參堿對細胞培養上清中分泌的HBV抗原亦有較強的抑制作用，尤其是在同一濃度下，都表現出對分泌的HBeAg的抑制率高于對HBsAg的抑制率。HBV基因組有4個開放讀碼區：S基因區、C基因區、P基因區和X基因區，分別編碼不同的抗原產物[9]。它們的基因表達分別由各自獨立的啟動子調控[10]，HBeAg由3.5kb的前C基因組mRNA編碼產生24KDa的多肽，然后轉運到內質網和高爾基體并經細胞蛋白酶剪切后形成16KDa的HBeAg，最后分泌到細胞外。HBsAg由S基因區轉錄產生的2.1kb和2.4kb的mRNA翻譯產生，單獨或包裝成HBV的外殼再分泌到細胞外。因此可能由于氧化苦參堿對S基因區和C基因區啟動子的調控能力不同，從而對HBeAg的抑制能力優于對HBsAg的抑制。結合以上結果推測，氧化苦參堿可能直接作用于HBV DNA水平（轉錄前水平），亦或干擾了包括逆轉錄酶和抗原在內的蛋白質合成及后加工，所以對HBV DNA及抗原都有較好的抑制作用。

　　我們的研究結果證實IFN-α能抑制轉染細胞系HBV的復制，與既往其他研究報告一致，并印證我們此次細胞模型的可靠性。氧化苦參堿能明顯抑制HepG2-2.2.15細胞HBV DNA的復制，顯著降低細胞培養上清液分泌性的HBsAg、HBeAg，證明其具有直接的抗HBV活性。其他有關研究還提示其還具有免疫調節[11]、抗肝纖維化[12]等作用，并且價格低廉，無明顯毒副作用，因而，無論是單獨應用，亦或設想與核苷類似物或IFN聯合治療慢性乙型病毒性肝炎，都可能是一種有潛力的藥物，值得更深入研究。

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