【摘要】 目的 研究西羅莫司對氯化鈷（CoCl₂）誘導的肝癌HepG2細胞中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達的影響。方法 用CoCl₂誘導細胞模擬缺氧微環境，并根據CoCl₂濃度不同分為0、50、100、200及400 μmol/L組；選擇CoCl₂濃度為200 μmol/L來模擬腫瘤內缺氧微環境，同時分別聯合0、10、20、30、40 nmol/L的西羅莫司作用于細胞24 h。應用逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測HIF-1α mRNA的表達。

    結果 隨CoCl₂濃度提高，HIF-1α mRNA的表達升高（F=103.67,q=4.83～24.15,P<0.05），其中CoCl₂濃度為200和400 μmol/L兩組比較差異無顯著性（q=0.69,P>0.05）；西羅莫司可使HepG2細胞HIF-1α mRNA的表達降低并呈劑量依賴性（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。

    結論 缺氧微環境可以促進HepG2細胞中HIF-1α mRNA的表達，HIF-1α可能通過在細胞缺氧調控中起作用而參與了腫瘤的發生發展。西羅莫司可以抑制HIF-1α mRNA的表達，這可能是其抗腫瘤的機制之一。

　　由于腫瘤細胞的失控性生長導致耗氧量的增加，缺氧成為腫瘤細胞生長的基本環境，腫瘤細胞如何適應這一微環境并保持持續生長已成為腫瘤研究的中心問題。缺氧誘導因子-1（HIF-1）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，HIF-1α是惟一的氧調節亞單位,決定HIF-1的活性，而HIF-1直接調控VEGF基因的表達，是惡性腫瘤誘導新生血管形成的主要調控因子。

    西羅莫司（SRL）是從吸水性鏈霉菌發酵液中提取出的一種大環內酯類抗生素，研究顯示SRL不僅有抗移植免疫排斥反應作用，而且還有廣泛的抗腫瘤作用。本文用氯化鈷（CoCl2）化學模擬誘導肝癌HepG2細胞內缺氧，再加不同濃度SRL培養，觀察細胞內HIF-1α表達變化，并對其發生機制進行初步研究。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
    RPMI 1640培養基為美國Gibco公司產品；胎牛血清為美國Gibco公司產品；SRL為Sigma公司產品；Trizol試劑盒購自Introvigen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promege公司；引物及GAPDH內參由上海生工生物工程公司提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 細胞培養
　　人肝癌HepG2細胞由南京凱基生物科技有限公司提供。將肝癌HepG2細胞接種于含體積分數為0.10的胎牛血清的1640培養基,內含100 U/L青鏈霉素，在37 ℃、體積分數為0.05的CO₂、正常氧濃度與飽和濕度的培養箱中培養，進入對數生長期后，傳代于6孔細胞培養板中，選擇生長良好的肝癌細胞用于實驗。
　　1.2.2 實驗分組
　　對照組用培養液培養48 h，實驗組用培養液培養24 h后，用含不同濃度CoCl₂的培養液處理細胞24 h，根據CoCl₂濃度不同分為5個亞組（0、50、100、200和400 μmol/L組）； 選擇CoCl₂濃度為200 μmol/L來模擬腫瘤內缺氧微環境，用培養液培養細胞24 h后，對照組用200 μmol/L的CoCl₂培養液培養24 h，實驗組用含SRL分別為0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl₂培養液培養24 h。
　　1.2.3 RT-PCR
　　TRIZOL法提取6孔板內各組細胞的總RNA，紫外線分光光度計測定總RNA濃度，重復測定3次，-70 ℃冰箱保存。

    各樣本取1 μg總RNA，按Promege一步法使用說明書進行RT-PCR；所用引物由上海生物工程技術有限公司合成：HIF-1α上游引物序列為5′-ACGTGTTATCTGTCGCTTTG-3′,下游引物序列為5′-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′,目的片段長度為371 bp；內參照基因GAPDH的上游引物序列為5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，目的片段長度為146 bp。

    RT-PCR反應條件：45 ℃逆轉錄45 min，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，68 ℃延伸2 min，27次循環后68 ℃終末延伸7 min。取出5 μL PCR 產物，加1 μL Loadingbuffer，反復吸打混勻后，于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電流為10 mA，電源120 V，電泳30 min，長波紫外線下觀察電泳條帶情況并照相，GIS凝膠成像處理系統成像，并進行吸光度定量分析。

    PCR 產物相對量=擴增產物的吸光度值/GAPDH 擴增產物的吸光度值。陽性結果為HIF-1α的RT-PCR產物電泳后在紫外線燈照射下出現371 bp的熒光條帶。
　　1.2.4 統計學處理
　　采用SPSS 10.0及PPMS 1.5統計分析軟件對數據進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析。
　　2 結 果
　　2.1 不同劑量CoCl₂對肝癌HepG2細胞中HIF-1α mRNA表達的影響
HIF-1α mRNA在0、50、100、200和400 μmol/L的CoCl₂處理組表達強度分別為0.79±0.04、0.94±0.03、1.06±0.02、1.14±0.02、1.13±0.03，隨著CoCl₂的濃度的升高HIF-1α mRNA表達增強（F=103.67,q=4.83～24.15,P<0.05），其中CoCl2濃度為200和400 μmol/L兩組比較差異無顯著性（q=0.69,P>0.05）。RT-PCR產物的電泳結果見圖1。
　　2.2 不同劑量的SRL對肝癌HepG2細胞中HIF-1α mRNA表達的影響
HIF-1α mRNA在含SRL分別為0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl2培養液處理組中的表達強度分別為1.10±0.03、1.04±0.02、0.95±0.03、0.84±0.03、0.70±0.03，隨著SRL濃度的升高HIF-1α mRNA的表達減弱（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。RT-PCR 產物的電泳結果見圖2。
　　3 討 論
    肝細胞癌惡性程度高,進展迅速,術后易復發和轉移,目前尚缺乏有效的治療藥物。肝細胞癌為典型的多血管腫瘤,抗血管生成在其治療中有著誘人的前景。缺氧誘導因子HIF-1最先由WANG等在研究低氧誘導的基因表達時發現，它是在缺氧條件下廣泛存在于人體內，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成異源二聚體的轉錄因子，其中HIF-1α是主要活性單位，其表達受氧分壓調節。

    HIF-1α感受缺氧信號后，自身被迅速激活，進入核內與其他轉錄因子協同作用并結合到缺氧相關基因的調控元件，調控相關基因的表達，以維持細胞和機體的氧自穩平衡及能量代謝平衡。而缺氧是實質性腫瘤物理微環境之一，所以HIF-1α對于腫瘤的生長尤為重要。鑒于此點，我們選擇HIF-1α為研究指標，探討SRL抗腫瘤作用的可能機制。
    本研究利用在培養液中加入CoC_l2的方法模擬細胞缺氧環境，這里CoCl₂的作用與低氧一致，Co²⁺是亞鐵螯合酶的底物，可取代細胞中的Fe²⁺與血紅素結合，使原卟啉Ⅸ與O₂分子的結合能力下降，阻斷O₂信號的傳遞，導致細胞內環境處于乏氧狀態，誘導HIF-1α的表達。同時，Co²⁺還能通過替代作為脯氨酰羥化酶（PHD）輔助因子的Fe²⁺，抑制PHD對HIF-1α的羥基化作用，減少HIF-1α的降解。

    本研究結果顯示，利用低濃度的CoCl₂預處理細胞，HIF-1α的表達隨著缺氧程度的增高而增強，提示無論在常氧還是低氧條件下，HIF-1α在肝癌HepG2細胞均中有表達，且隨著CoCl₂濃度的增高，即缺氧信號的加強（實質性腫瘤發展越快,氧供的不平衡就越明顯），其mRNA表達水平上調。

    其可能的機制為：當氧需求量絕對或相對增加，腫瘤細胞可通過啟動缺氧應答的開關“HIF-1”，使其表達上調，最終啟動一系列下游基因轉錄，其產物使腫瘤細胞適應缺氧的應激狀態繼續存活和增殖。
    SRL是一種大環內酯類化合物，具有抗真菌和增強免疫抑制活性的作用，目前作為免疫抑制劑廣泛應用于臨床。最近研究結果顯示，SRL具有廣泛的抗腫瘤作用，如抗胰腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腎癌等。研究表明，在低氧環境激活HIF-1α的過程中，mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑起了進一步放大效應。

    以往研究顯示，抑制mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑對實體腫瘤，特別是惡性程度高或對化療耐藥的腫瘤，具有治療意義。SRL通過特異性抑制mTOR而抑制HIF-1α的激活，可有效下調HIF-1α基因的表達，既能抑制HIF-1α基因的合成，又能增加其降解，并能下調HIF-1α基因調控的其他基因的表達。
    本實驗結果顯示，SRL能明顯使肝癌HepG2細胞HIF-1α mRNA表達下降，且隨著SRL濃度的升高，HIF-1α mRNA的表達也越來越低。由此推測，SRL可以通過上述信號途徑，阻斷HepG2細胞表達HIF-1α mRNA，進而抑制其下游基因VEGF的表達，從而抑制腫瘤的發生發展，這可能是其抗腫瘤的機制之一。
    總之，近年來抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的基礎和臨床研究熱點，是最有希望的腫瘤導向治療靶標。尤其是研制以HIF-1為治療靶點的腫瘤治療藥物，已成為抗腫瘤治療研究的熱點，通過抑制HIF-1α蛋白表達來抑制受其調控的多種促腫瘤生長相關基因的表達水平，從多方面入手抑制腫瘤的發生和發展。

    本研究通過對SRL抑制人肝癌HepG2細胞中HIF-1α表達的研究,進一步揭示其抗腫瘤血管生成的作用機制，為開發抗腫瘤血管生成新藥奠定理論基礎，為臨床應用提供理論依據。