蘭  林，王宇明

　　蘭林，王宇明,中國人民解放軍第三軍醫大學西南醫院全軍感染病研究所 

 

　　摘要

　　迄今IFN-α仍是治療乙型肝炎的主要抗病毒藥物，但其總體療效并不理想.究其原因，HBV基因組的多樣性可能是重要原因之一.HBV種群具有高度的異質性，存在著多種不同的血清型、基因型及變異株，即使在單個感染個體內，也可能包含異質性的HBV病毒群體（準種）.研究發現不同的HBV株對IFN-α治療的敏感性不同，個體內準種的異質性程度也對擾素治療的應答性有影響.因此，正確深入地認知和分析HBV遺傳異質性，對闡明影響IFN-α治療的病毒學因素有著重要的意義.

　　蘭林， 王宇明.乙型肝炎病毒遺傳異質性對干擾素應答性的影響.世界華人消化雜志 2002;10(6):696-698

　　

　　0  引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是目前威脅人類健康的最主要病原體之一. 他屬于嗜肝DNA病毒科（hepadna viridae）家族. 其基因組由一個呈部分雙鏈、松馳的環狀DNA分子構成，DNA大約長3200（3182～3221）個堿基（bp）對. 其上有4個開放閱讀框（open reading frame，ORF），轉錄至少4種mRNA，即3.5kb mRNA、 2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.7kb mRNA，其中3.5kb mRNA又是病毒的前基因組RNA（pregenome RNA）. 翻譯至少7種病毒蛋白質；S-ORF區的PreS1蛋白、PreS2蛋白和HBsAg，C-ORF區的HBeAg和HBcAg，P-ORF區的DNA聚合酶及X-ORF區的X蛋白. HBV基因組轉錄調控因子包括4種啟動子（promoter）、2種增強子（enhancer）和多種其他cis活性因子區. 其中核心啟動子又可再分為核心上游調節序列（core upstream regulatory sequences，CURS）和基本核心啟動子（basic core promoter，BCP）2區. cis活性因子區有；位于S基因內的糖皮質應答元件（glucocorticoid responsive element，GRE），位于C基因上游的負性調節元件（negative regulatory element, NRE），肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）結合位點，Sp1結合位點，位于C基因之中的轉錄終止信號（termination signal）以及最近在增強子I區域內新發現的干擾素（interferon，IFN）刺激調節成分（interferon-stimulated regulatory element，ISRE）樣區域等. 病毒基因組存在著明顯的基因重疊現象. HBV最大的特點是復制必需經過核糖核酸中間體（RNA intermediates ）逆轉錄（reverser transcription）過程. HBV種群的異質性很大，按血清學分類可分為adr 等9 種血清型，按基因型分類可分為A～G共7種基因型. 別外各型還存在著眾多的變異株.

　　      HBV感染可引起一系列的嚴重疾病，如暴發性肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化及肝細胞肝癌. 全球超過3億人口是慢性HBV攜帶者，在我國HBsAg陽性率達到總人口的10％. 目前使用的有效抗病毒藥物主要有IFN-α和拉米夫定（lamivudine）. 拉米夫定是一種新使用的核苷類似物抗病毒藥，其遠期療效尚需確認，初步結果提示他易誘導病毒變異株出現，從而產生耐藥；同時，因不能清除cccDNA分子，易致停藥后反跳；對HBeAg血清學轉換效果不佳，且療程偏長［1]. IFN-α屬于IFN-α/β系統，具有抗病毒、抗增生、免疫調節作用及其他細胞效應. 在人體，IFN-α通過兩條途徑產生抗病毒作用；一是誘導感染細胞表達至少3種抗病毒蛋白；2''-5''寡聚腺苷酸合成酶、dsRNA-依賴的蛋白激酶和Mx蛋白，使細胞處于抗病毒狀態. 二是調節機體免疫反應. 然而至今IFN-α抗HBV的確切機制并不完全清楚. 因為缺乏動物模型，有關IFN-α抗HBV的研究大部分是在體外進行的. 由于使用的肝癌細胞株不同，各研究者所得到的結果也不完全相同，不過大多數研究發現IFN-α能改變HBV多種蛋白質的合成�能箚緳n筒《狙腔�因组RNA和病毒前基因組的穩定性. IFN-α的免疫調節作用是多方面的，主要表現在以下幾個方面［2，8]： (1)增強MHC I型和II型抗原的表達和多種受體的表達，如；白介素-2受體（IL-2R）、腫瘤壞死因子-α受體（TNF-αR）、巨噬細胞膜上的Fc受體； (2)增強細胞毒性T淋巴細胞、NK細胞和ADCC作用的活性； (3)直接作用于B細胞影響抗體的生成. 在IFN-α治療的早期，病毒產物合成減少與其誘生的抗病毒蛋白有關，隨后持續的療效主要與其免疫調節作用有關［4]. 雖然IFN-α的抗病毒作用已經被普遍認可，但HBeAg 和HBV DNA的陰轉率僅比對照組高20%， HBsAg 的陰轉率僅比對照組高5～6％［5]. 影響IFN-α應答性的因素亦尚不清楚. 研究發現除宿主方面的因素外，在病毒方面，不同的病毒株對IFN-α有不同的敏感性，多種變異株顯示對IFN-α有特別的抵抗力，HBV準種的復雜程度也對IFN-α的應答性有影響.現將有關研究綜述如下；

　　1  HBV基因型對IFN-α應答性的影響

　　根據HBV基因組全序列的差異（>8％），或S基因序列的差異（>4.1%）［6]，HBV基因組可分為7個基因型（A～G）. 不同的基因型存在明顯不同的地域分布和不同的致病能力. A型呈全球性流行，但主要分布在西北歐、北美和中非. B型主要發現在中國和東南亞. C型主要分布在中國和東亞. D型分布在地中海、中東和印度. E型分布在非洲. F型流行在美洲土著人和波利尼西亞群島. G型是2000年新發現的基因型，首先發現在美國亞特蘭大和法國里昂［7]. 在中國，一般認為主要的流行型是B型和C型，這與臺灣地區的流行型相同［8]. 其中，南方以B型為主，北方以C型為主. C型常引起嚴重的肝臟損害，而B型感染病情較輕但容易引起肝硬化［9]. 除此之外，研究還發現不同的基因型對IFN-α的應答性也不相同. 臺灣學者Kao et al［10］報道了58例B型和C型慢性感染患者IFN-α2b治療的結果，B型和C型的應答率分別是41%和15％（P=0.045）. Sangfelt et al［11］用IFN-α治療A～D四種基因型感染的兒童，其中獲得良好應答的都是所謂非亞洲型的A和D型. Zhang et al［12］報道在A、D和E 3個HBV基因型中，A型對IFN-α的應答率最高為75％，而D和E型則勻為40％. Erhard et al［13］報道，A、B、C和D四個基因型對IFN-α的應答率分別是50%、4%、8%和38%. 另外還有報道，不同的基因型發生PreC區和BCP區突變的概率不同［14]，已有研究報道這些區域的突變對IFN-α的應答性有影響. 所感染HBV的基因型不同可能也是我國乙型肝炎容易慢性化和難以治療的原因之一.

　　2  HBV變異對IFN-α應答性的影響

　　HBV雖然是DNA病毒，但因其復制過程的特殊性，HBV的自發突變率超過其他DNA病毒約4個數量級［15]. 在過去的10多年中，有關HBV變異臨床意義的研究一直是熱點之一. 有關病毒變異對IFN-α應答性影響的研究報道也很多. 由于HBcAg和HBeAg 在機體免疫應答中所起的特殊作用，因此研究主要集中在HBcAg和HBeAg的編碼區和相應調節區的變異. 目前報道的位點主要有BCP、CURS、NRE、PreC區、C區突變和ISRE［16-18］.

　　      BCP（1 742～1 849 nt）、CURS（1 643～1 742 nt）和 NRE（1 611～1 634 nt）均位于X基因區內. BCP 和CURS控制3.5kb mRNA轉錄，NRE的功能是拮抗BCP 和CURS的作用. 此區最常見的突變是A1762T和G 1764A. 突變的后果是HBeAg的合成量下降約70％，但HBcAg的合成和病毒前基因組的生成不受影響，病毒的復制能力增加［19］. Erhard et al［13］研究了這3個區域的突變對IFN-α應答性的影響后發現；CURS和NRE區域的突變與IFN-α的應答性無關. BCP區域的突變除A1762T和G 1764A外，重要的還有1753～1766nt區間的突變（在此區間聚集有HNF4、和Sp1等轉錄因子結合位點）. IFN-α的應答性與這些突變相關，但結果在HBeAg陽性和陰性患者之間截然相反，在HBeAg陽性的患者，IFN-α完全應答率與整個BCP區，特別是與1753～1766nt區域堿基突變數成正比（P<0.04，P<0.015）,亦與A1762T和G1764A突變呈顯著相關（P<0.007）. 在HBeAg陰性的患者，IFN-α完全應答率與整個BCP區，特別是與1753～1766nt區域堿基突變數成反比（P<0.04，P<0.02）, 1762nt和1764nt為野生型者應答性高（P<0.003）.

　　      PreC區和C區突變對IFN-α應答性的影響. Pre-C區突變的研究主要集中在G1896A nt終止突變［20]，C區突變的研究主要集中在CTL識別表位（HBcAg18～27aa）的變異上［21]. Zhang et al［22］報道35例成人患者在IFN-α治療后發現；IFN-α的應答應性與治療前HBV DNA水平和IFN-α的用量無關. 獲得應答者 PreC區多為野生型，而非應答者嚶兄罩雇槐洌í玃<0.002）. Brunetto et al［23］報道了115例意大利患者的研究，結果與Zhang的報道相一致，另外還發現PreC區終止突變同時也影響HBV的自然清除，在有PreC區終止突變病毒感染的患者，自然清除率只有19％，而野生型則高達47%. 美國學者Naoumov et al［24］發現在IFN-α應答者中，PreC區和C區的錯義突變明顯少于非應答者（P<0.001）,并且發現在非應答者中全部存在HBcAg 18～27位氨基酸的替換. Fattovich et al［25］研究發現IFN-α非應答者在C區內B-細胞和T-細胞識別表位有更多的氨基酸替換. 提出可根據C區的變異預測患者對IFN-α的應答性. 但希臘學者Alexopoulou et al［26］和日本學者Shindo et al［27］的研究結果與上面的報道完全不同，他們的研究指出HBV PreC區和C區突變與患者對IFN-α的應答性無關.

　　      ISRE通常存在于IFN-α誘導基因啟動子中的一段序列（AGTTTCNNTTTCNC）. Nakao et al［28］首先在HBV增強子I內發現了一段相似序列（AGGCTTTCACTTTCTC），同時也在HBV和IFN-α處理過的細胞核提取物中發現；IFN刺激因子-3（interferon-stimulated gene factor 3 ，ISGF3）家族的ISGF3-γ（作者命名為p48）能與HBV增強子I內這段序列結合并且抑制了增強子I的活性，這段序列的突變和缺失都會減少IFN-α對HBV的抑制效果. 不過遺憾的是隨后Rang et al［29］和其同事的跟蹤研究并沒有重復出相同的結果. 這片段序列的改變是否會影響對IFN-α的應答性尚需進一步研究.

　　3  HBV準種復雜性對IFN-α應答性的影響

　　病毒的準種（quasispecies）特性及其臨床意義近來受到了越來越多的關注. 準種是復雜的、處于動態分布的彼此相關但又不完全相同復制子的集合（準種各成員之間，其差異程度一般不超過核苷酸總長度的2～5％）. 這是Eigen最早用于描述地球上早期生命形式的一個理論模型. 準種包括一個或幾個主導序列（master sequence）和一個變異譜（mutant spectrum）. 主導序列是群體中的最適序列，他可與共有序列（consensus sequence）一致，亦可能不同. 復制的忠實性決定著突變譜的大小. 整個集合共同處于環境的選擇壓力之下維持著動態平恒. 準種理論與以前的群體生物學理論最大的區別是；不認為野生型是一個有明確核酸序列的單獨的基因組，而是多種密切相關基因組構成的一個整體［30］. 在病毒學領域，目前準種的研究主要集中在RNA病毒，因為RNA病毒變異大，復制快，在很短的時間內感染個體中即可形成一個彼此密切相關的異質性病毒群體. 研究最多的是HCV和HIV. 病毒的準種特性實質上是其進化的一種生存優勢，病毒最大限度地"制造"自己的大量變異序列，這些序列中可能包括了潛在有用的變異體，如對抗病毒制劑有抵抗能力、能逃避CTL攻擊和誘導免疫耐受的突變體. 這樣當環境改變后病毒可以快速的作出反應，從而保證其在宿主體內的生存. 最近的研究還發現病毒準種象人體免疫系統一樣具有記憶能力［31]，當準種再次遇到經歷過的環境作用時，保存在突變譜內的少量病毒株將迅速大量復制成為準種的主導序列.因此如果病毒準種的復雜性越大，治療難度就可能越大. 在HCV的研究中已發現，病毒準種的異質性越大，對IFN-α的應答性就越差［32].有學者提出作為DNA病毒的HBV也存在準種特性. 已有少量的研究報道證實了這種假說［33]，有關HBV準種復雜性與IFN-α應答性之間相關性研究尚未見報道. 從我們最近的研究結果發現，HBV不僅存在準種特性，且在慢性乙型肝炎中準種的復雜性和異質性還很大. 同時也發現，在IFN-α應答的患者中，準種的復雜性明顯小于非應答患者，這與在HCV的研究發現相一致.

　　      總之，可見HBV的遺傳異質性對IFN-α應答是有影響的. 然而，過去很多研究僅根據從患者血清中分離出的單個或少數幾個病毒株或基因片段來判斷某一變異株對IFN-α治療的影響，這是不準確的，因為他們僅僅窺視了病毒準種的少數成分，慢性乙型肝炎患者血中HBV DNA拷貝數常在百萬至十億之間，隨機抽取單個或少數幾個克隆株不可能代表其準種組成，所以難免得到一些彼此矛盾的研究結果. 分析HBV對IFN-α應答性的影響，必須注意到病毒的準種特性. 在我國大多數的HBV感染者是通過母嬰垂直傳播感染的，大多經過了一個很長的感染期，部分患者還可能已經接受過多種/多次的抗病毒治療. 在其體內早已形成了一個復雜的異質性的病毒群體，因此對HBV準種特性的研究顯得尤其重要. 準種理論與既往群體生物學理論的最大差別是；不再把野生型看成一個有確定核酸序列的單個基因組，而看成一群密切相關基因組構成的一個整體. 準種理論最大的特點是；從患者體內整個病毒群體水平上去認識病毒的生物學特性及臨床意義，不再注重某種單個的野生型或變異株的作用. 準種理論指導我們從一個全新的方式去認識HBV的生物學特性及臨床意義. 通過對HBV準種生物學特性以及HBV準種的形成與急性HBV感染的慢性化、慢性HBV感染的臨床轉歸之間的相互關系的深入研究，可能為探索抗HBV感染的治療方法提供重要線索.

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