Sorafenib最初是在對CRAF激酶抑制劑先導物進行結構-活性評價的生化分析中被發現的。在體外，sorafenib是CRAF和野生型及突變型(V600E)BRAF的有效的抑制劑。Sorafenib還抑制參與腫瘤進展和血管生成的幾種RTKs，包括人VEGFR-2，小鼠VEGFR-2，VEGFR-3和PDGFR-β，FLT3和c-KIT。在人乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和結腸癌細胞系中，sorafenib降低了細胞內MAPK途徑的基礎磷酸化水平，但對表達突變KRAS的NSCLC細胞系NCI-H460或A549細胞無此作用。在表達野生或突變型KRAS或BRAF的人乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和結腸癌細胞系中，sorafenib抑制了細胞內MAPK途徑的信號傳導。

 

·Sorafenib是RAF激酶的強抑制劑，所抑制的RAF激酶包括CRAF、野生型和突變型(V600E)BRAF及在腫瘤進展中發揮作用的幾種RTKs。

· Sorafenib在體內具有廣譜的抗腫瘤活性。在表達突變RAS和/或BRAF的負瘤小鼠模型，及經RAS/RAF/MEK途徑傳導生長信號的負瘤小鼠模型中，sorafenib的治療抑制了腫瘤的生長。

·Sorafenib通過抑制VEGFR2，VEGFR3和PDGFR-β，而減少了血管生成信號的傳導。因而，可通過直接和間接機制共同抑制腫瘤生長。

 

表4-1總結了sorafenib的生化活性及細胞藥理學結果(21)。sorafenib，是CARF和野生及突變(V600E)BRAF的強抑制劑，體外IC 50分別為2nM，22nM和38nM(22)。sorafenib還抑制幾種參與腫瘤演化和血管生成的RTKs，包括FLT3， c-KIT，VEGFR-2，VEGFR-3和PDGFR-β。即使藥物濃度高達10μM，sorafenib對MEK-1,  ERK-1, EGFR, HER2/NEU, c-MET, PKA, PKB, IGFR-1, Cdk-1/cyclin B, PIM-1, GSK 3-, CK-2, PKC-, PKC-ß, 或 PKC-。

Sorafenib對牛p59 FYN激酶的IC50為780nM，說明藥物對此激酶沒有顯著的抑制作用。對非激酶靶位，sorafenib對腺苷A3，多巴胺D1和毒蕈堿M3受體有輕微的的抑制作用，IC50分別為1.6μM，2.0μM和3.1μM。

表4-1：Sorafenib對激酶靶位的體外活性

在體外，sorafenib對乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和結腸癌細胞的RAF/MEK/ERK途徑的信號傳導有顯著的抑制作用，表現為表達野生型或突變型KRAS或BRAF的細胞的pERK水平降低。然而，對于NSCLC細胞系A549和H460細胞，即使sorafenib的濃度高達20M，仍然沒有觀察到藥物對RAF/MEK/ERK途徑的信號傳導有抑制作用。藥物對這些細胞系內ERK磷酸化無抑制作用的原因尚不清楚。Sorafenib對表達在增生的血管內皮細胞內的(VEGFR2)、淋巴生成內皮細胞內的(VEGFR3)、和人大動脈平滑肌細胞的(PDGFR-β)靶受體的磷酸化也有抑制作用。VEGF和PDGF受體在腫瘤新血管生成中起重要作用(15, 20)。因此，sorafenib一方面通過抑制VEGFs和PDGF受體而阻斷腫瘤新血管生成，另一方面通過抑制RAF/MEK/ERK途徑的信號傳導而抑制腫瘤生長。

 

.1).單劑藥效

在表達突變的KRAS(HCT-116, DLD-1, Mia-PaCa-2)或BRAF(Colo-205，HT-29)的腫瘤模型中，sorafenib顯示了抗腫瘤作用。對于表達上述兩種突變基因的MDA-MB-231模型，藥物仍然有效。對表達野生型RAS和BRAF、但不過表達EGF和HER2生長因子受體的人卵巢癌細胞，sorafenib也顯現了療效。這些受體也是通過RAF/MEK/ERK途徑傳導信號。Sorafenib在這些腫瘤模型上顯現出療效，提示RAF激酶抑制劑不僅對表達RAS和/或突變的b-Raf的人腫瘤有效，對其他通過此信號傳導通路傳遞信號的、生長因子受體過度表達的的腫瘤也有效。最后，sorafenib對表達活化的突變型FLT-3的MV4：11AML模型也有效。表4-2總結了Sorafenib在人腫瘤異體移植物模型中顯示的體內廣泛的抗腫瘤活性。

 

表4-2：在臨床前異種移植物模型中，sorafenib的抗腫瘤活性

 

劑量從7.5mg/kg/天到90mg/kg/天時，sorafenib在RENCA小鼠RCC模型中也顯示了很強的抗腫瘤活性(腫瘤生長抑制率為30%到84%)。

在無胸腺小鼠A498和CAKI-1人腎癌異種移植模型中，進行了藥物的初步的抗腫瘤療效研究。在劑量高達60mg/kg時，sorafenib仍然沒有顯著抑制CAKI-1腫瘤的生長(25)。然而，當sorafenib的劑量為60mg/kg時，在研究期間，70%的A498腫瘤的的大小沒有加倍(26)。相對于對照組腫瘤的生長程度，本研究中藥物沒有顯現出明顯的腫瘤生長抑制作用。如果劑量提高或者給藥時間延長，sorafenib可能會表現出明顯的腫瘤生長抑制作用。在兩種腎癌模型中，癌細胞對Sorafenib的敏感性不同，藥物作用也有差別，但是原因尚不清楚。

在DLD-1結腸癌模型，多療程sorafenib治療是有效的(27)。單療程Sorafenib治療，藥物對小腫瘤或大腫瘤的生長都有抑制作用。藥物對腫瘤生長的延遲作用與治療持續時間成正比，而與治療初期腫瘤的大小無關。與單一療程的療效相比，兩療程、每療程10天的治療使腫瘤生長延遲近乎2倍，而30天的持續治療使腫瘤生長延遲近乎3倍。值得注意的是，在第一療程治療中腫瘤生長受抑制，但是中止治療后腫瘤生長也恢復了，這時開始sorafenib第二療程的治療仍然可以達到抑制腫瘤生長的目的。

 

.2).作用機制

在多種在體腫瘤模型中研究了sorafenib的作用機理，包括HT-29, DLD-1, HCT-116, 和 Colo-205 結腸癌模型, MDA-MB-231乳癌模癌模型(21, 28)。在每個研究中，負荷大約200毫克腫瘤的動物，給予型和Mia-PaCa-2胰腺sorafenib(30-60mg/kg/劑)，為期5天。末次給藥后3小時取下腫瘤，用Western染色和/或免疫組化(IHC)方法，評價sorafenib對RAF/MEK/ERK信號傳導通路的作用。在一些實驗中，腫瘤樣品還進行了抗CD31的山羊多克隆抗體染色和影像分析微血管密度以評價藥物對新生血管生成的抑制作用。從HT-29和Colo-205腫瘤模型得到的結果驗證了這些評價得出的結論。

每組4只小鼠移植了人結腸腫瘤，當腫瘤長至至100到200毫克時，小鼠口服劑量為30mg/kg或60mg/kg的sorafenib，每日1次，共5天。用抗-pERK和抗-ERK抗體進行Western blot分析，結果表明，sorafenib抑制了HT-29內RAF/MEK/ERK信號轉導通路的活化，但是對Colo-205人結腸癌無效。雖然在HT-29和Colo-205結腸癌腫瘤異種移植模型中，sorafenib都顯著抑制了腫瘤的生長，但是用Western blotting或IHC的方法分別分析Colo-205腫瘤，都未能發現藥物對ERK1/2磷酸化的顯著的抑制作用。提示sorafenib的治療未能有效阻斷RAF/MEK/ERK途徑的信號傳導。在Colo-205和HT-29細胞內都存在同樣的V600E b-Raf突變，大概是這些細胞異常增殖的原因。可能存在另外一條途徑，而不是RAF/MEK/ERK級聯反應，活化了Colo-205腫瘤內的ERK1/2。與此相反，盡管在Colo-205腫瘤樣本中，sorafenib的治療未使RAF/MEK/ERK途徑的信號傳導受到抑制，但是Colo-205腫瘤樣本與HT-29腫瘤樣本一樣，微血管區面積和密度都降低了50%到80%。

 

合成了sorafenib的三種代謝物(M-2, M-4和M-5)，并研究了它們對野生型c-Raf和b-Raf，mPDGFR-β, mVEGFR-2和人FLT－3的生化活性(38)。M-2和M-5對mPDGFR-β的抑制作用明顯強于sorafenib。然而，sorafenib對c-Raf和野生型及突變型b-Raf的抑制作用顯著強于M-2和M-5。Sorafenib對FLT-3的抑制作用明顯強于M-5或M-4。

總的來說，代謝物的細胞內效應與sorafenib的基本一致。ERK磷酸化水平，用于衡量RAF/MEK/ERK途徑信號傳導抑制程度；在MDA-MB-231乳腺癌細胞內，這些化合物對ERK磷酸化的抑制作用沒有差別，IC50為90到151nM。兩個代謝物，M-2和M-5，對PDGF介導的人大動脈平滑肌細胞增生的抑制作用顯著強于sorafenib。NIH-3T3纖維細胞轉染小鼠VEGFR2后，觀察藥物對VEGFR2自動磷酸化抑制作用的IC50，代謝物的IC50為12到30nM，與sorafenib相比沒有顯著差別。

 

在兩個獨立的研究中，用MDA-MB-231人乳腺癌NCr裸鼠模型，比較了BAY67-3472(M-2)及其母體化合物Sorafenib的抗腫瘤效應(39)。在這兩個試驗中，每個制劑的口服劑量為30, 60和120mg/kg，給藥方法為QD×9。如前所述，采用本研究中的給藥方案，sorafenib口服劑量為30mg/kg時，可完全抑制MDA-MB-231腫瘤的生長。因此，采用這一劑量直接比較兩個化合物的抗腫瘤活性。此外，基于以前的經驗，即當劑量超過120mg/kg時，sorafenib的全身藥物濃度不再升高，因此在兩個研究中BAY67-3742采用的最高劑量為60和120mg/kg。BAY67-3742 120mg/kg的劑量，已經達到本研究所使用的賦形劑PEG400/MSA溶解的最大極限。

Sorafenib組動物耐受性良好，體重僅降低4%-5%，沒有動物死亡。如前所述，在此模型上Sorafenib的療效顯著，與模型對照組相比，腫瘤生長抑制率(TGI)為80%-91%。BAY67-3472的耐受性也較好，動物體重減輕了2%-7%，沒有動物死亡。BAY67-3742劑量為30mg/kg時，TGIs為38%；劑量為120mg/kg時，TGIs為68%。因此，BAY67-3472的作用強度和有效性都低于sorafenib。兩藥給藥途徑及給藥方案相同的條件下，BAY67-3472的劑量為120mg/kg時產生的腫瘤生長抑制作用(TGI為63%到68%)，弱于sorafenib劑量為30mg/kg時產生的效應(TGI為80%到91%)。

在單獨的研究中測定了NCr小鼠口服BAY67-3472后，BAY67-3472和sorafenib的藥代動力學參數。BAY67-3472療效較低與NCr小鼠口服BAY67-3472后得到的血藥濃度較低有關。BAY67-3472口服劑量為30mg/kg時，得到的藥物血漿達峰濃度(Cmax)近似于4mg/L， 藥時曲線下面積(AUC)為25mg*h/L；而同樣劑量的sorafenib得到的Cmax比BAY67-3472高10倍，為33mg/L，AUC為326 mg*h/L(40)。至少BAY67-3472的一部分抗腫瘤療效是通過它在體內轉化生成母體藥物sorafenib而實現的。口服劑量為30mg/kg 的BAY67-3472后，血漿sorafenib的濃度非常低，但服藥后7h后與BAY67-3472的血藥濃度相同。Sorafenib口服后，再次服用BAY67-3472，得到的BAY67-3472的AUC(0-24h)約為58%-71%。口服30或60mg/kg BAY67-3472得到的各化合物的血藥濃度都低于劑量比例。

總之，這些數據說明，口服sorafenib的主要代謝物BAY67-3472，有利于藥物的抗腫瘤效應。在劑量比較實驗中，BAY67-3472的療效較母體化合物低。口服后得到的血漿母體藥物濃度較低的事實，已經足以說明此代謝物效應較弱的原因。然而，既然sorafenib主要代謝為BAY67-3472，此研究尚不能完全闡明BAY67-3472對sorafenib抗腫瘤活性的實際貢獻。

 

基于sorafenib體外效應，即在細胞機制研究中對CRAF的抑制作用，及其體內的廣譜抗瘤作用，sorafenib被選擇為臨床用藥候選之一。

Sorafenib時c-Raf和突變(V600E) BRAF的強抑制劑，還抑制在腫瘤演化過程中起重要作用的幾種RTKs，包括VEGFR-2，VEGFR-3，PDGFR-β,c-KIT和FLT-3。在表達突變RAS和/或BRAF腫瘤模型，和其他生長因子通過ras/raf/MEK途徑傳遞信號的腫瘤模型中，用sorafenib治療腫瘤負荷小鼠可使腫瘤生長受到抑制。除抑制腫瘤生長的作用外，sorafenib通過抑制腫瘤新血管生成，由此通過直接和間接機制控制腫瘤生長。研究了藥物在人體的主要代謝物(M-2)的體內抗癌效應，結果表明代謝物的有效性和作用強度小于sorafenib。