【摘要】目的 觀察外陰鱗癌(VSCC)組織中HPV感染情況及脆性組氨酸三聯體(FHIT)基因的雜合性缺失(LOH)、微衛星不穩定性(MSI)，并探討其意義。方法 選取VSCC組織24例、外陰尖銳濕疣(VCA)42例、正常外陰組織20例，用PCR法檢測上述組織中的HPV6、11、16、18、31、33亞型，用PCR一單鏈構像多態性分析(PCR-SSCP)法檢測FHIT基因D3S1300位點的LOH和MSI。結果 在正常外陰、VCA、VSCC組織中低危型HPV(HPV6/11)陽性分別為2、38、21例，高危型HPV(HPV16/18/31/33)陽性分別為0、13、10例；VCA、VSCC組織與正常外陰組織比較，P均＜0.05。在正常外陰、VCA、VSCC組織中，FHIT基因D3S1300位點上LOH、MSI陽性分別為0、9、13例，VSCC與VCA、正常外陰組織比較，P均＜0.05。VSCC組織中HR-HPV感染與FHIT基因D3S1300位點LOH/MSI相關(r=0.438，P＜0.05)。結論 VSCC組織中存在較高的低危型、高危型HPV復合感染及FHIT基因LOH和(或)MSI；二者在VSCC的發生發展中發揮重要作用。

【關鍵詞】人乳頭瘤病毒；脆性組氨酸三聯體基因；雜合性缺失；微衛星不穩定性；外陰鱗癌；外陰尖銳濕疣

 

脆性組氨酸三聯體(FHIT)基因是一種候選抑癌基因，惡性腫瘤及其癌前病變組織中常存在FHIT基因異常，如雜合性缺失(LOH)、微衛星不穩定性(MSI)等，與人乳頭瘤病毒(HPV)感染可能有關。高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)與宮頸癌和宮頸上皮內瘤變有關，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、68等亞型；低危型人乳頭病病毒(LR-HPV)與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關，包括HPV 6、11、42、43、44、54亞型等。2006~2010年，我們觀察了外陰鱗癌(VSCC)組織中HPV6、11、16、18、31、33基因型別感染情況及FHIT基因的LOH、MSI，探討二者在VSCC發展中的作用及相互關系。

 

1 材料與方法

1.1 材料 選取2004~2008年經病理確診的24例VSCC及42例外陰尖銳濕疣(VCA)患者的病變組織蠟塊，以外陰良性病變切除的正常外陰組織20例作為對照；試劑為dNTP、Taq酶；FHIT基因D3S1300位點引物核苷酸序列：F為5′-AGCTCA-CATTCTAGTCAGCCT-3′，R為5′-GCCAATrCCCCA-GATG-3′，產物片段長度為217~241 bp。HPV6、11、16、18、31、33亞型引物核苷酸序列，見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

 

1.2 HPV感染與FHIT基因LOH、MSI檢測方法 用PCR法檢測HPV6、11、16、18、31、33亞型，用PCR-單鏈構像多態性分析(PCR-SSCP)法檢測FHIT基因D3S1300位點的LOH和MSI。采用標準酚-氯仿-異戊醇法抽提組織DNA，TE溶解后4℃保存備用。PCR擴增體系(25μL)：DNA模板100~200ng，引物各0.5 mmolfL，每種dNTP各200mol/L，Taq酶1 U。反應條件：94℃預變性5min；35個循環的94℃ 變性30s，53.6℃(D3S1300，HPV6、11為50.9℃，HPV16、18為52.3℃，HPV31、33為47.6℃)退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。結束后經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。根據HPV擴增產物的相應長度判斷亞型結果(HPV6、11、HPVl6、18、HPV31、33擴增長度分別為263、144、471、268、448、462 bp)。取D3S1300擴增的PCR產物，變性后于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色并觀察結果。若病變組織比病變旁組織條帶增多、位置改變或濃度增加等記為MSI；若條帶消失或相對密度減少50%以上記為LOH。

 

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。組間比較用χ²檢驗或Fisher精確概率法，相關性分析用Spearman等級相關分析法。P40.05為差異有統計學意義。

 

2 結果

在正常外陰、VCA、VSCC組織中HR-HPV(HPV6/11)陽性分別為2、38、21例，HR-HPV(HPV16/18/31/33)陽性分別為為0、13、10例；VCA、VSCC組織與正常外陰組織比較，P均＜0.05。HPV的PCR產物擴增電泳圖，見圖1。

 

在正常外陰、VCA、VSCC組織中，FHIT基因D3S1300位點上LOH、MSI陽性分別0、9、13例；VSCC與VCA、正常外陰組織比較，P均＜0.05。FHIT基因D3S1300位點PCR產物擴增見圖2，PCR-SSCP電泳圖見圖3。

 

相關分析顯示，VSCC組織中HR-HPV感染與FHIT基因D3S1300位點LOH/MSI相關(r=0.438，P＜0.05)，LR-HPV與FHIT基因LOH/MSI不相關(r=0.158，P＜0.05)。VCA組織中LR-HPV及HR-HPV感染與FHIT基因LOH/MSI均不相關(r分別為0.169、0.027，P均＜0.05)。

 

3 討論

自從1996年發現FHIT基因以來，大量研究發現FHIT基因在頭頸部惡性腫瘤、肺癌、消化道惡性腫瘤、乳腺癌及宮頸癌等各類惡性腫瘤中存在廣泛異常，提示FHIT基因與惡性腫瘤的發生發展有關。惡性腫瘤及其癌前病變組織中FHIT基因的異常與HPV感染可能有關。

 

林云等研究發現，在VSCC中HPV16/18的感染率比正常對照組高，提示HPV感染可能在VSCC發生發展中起一定作用。本研究結果顯示，VSCC和VCA中均存在LR-HPV和HR-HPV的復合感染，且二者比較并無統計學差異。目前，尚無證據表明HR-HPV感染與VSCC的發生相關。

 

本研究結果顯示，VSCC組織中FHIT基因D3S1300位點LOH、MSI陽性率為54.2%，表明FHIT基因廣泛出現異常，與其他報道一致；VCA組織中也已出現FHIT的異常(陽性率為21.4%)，但較VSCC低(P＜0.05)。這提示FHIT基因異常與VSCC發生可能相關，VCA可能是VSCC的前期病變，FHIT基因異常可能是VSCC癌前病變的分子標志。D3S1300位點位于FHIT基因第1編碼外顯子(E5)附近，該位點出現高頻率的LOH和(或)MSI與FHIT基因異常轉錄本中E5的缺失相吻合，提示FHIT基因缺失在VSCC中較常見。

 

3p14.2、3p21被認為是LOH集中發生的亞區域，而FHIT基因定位于3p14.2。有研究者認為，HPV病毒可直接整合到FHIT基因脆性位點，引起染色體基因組的不穩定，這可能是HR-HPV致癌的機制之一。Buher等研究發現，FHIT基因LOH與HPV16、31感染有顯著相關性；而有研究發現，FHIT基因突變與HPV感染無關，二者是參與宮頸癌發生的兩個獨立致病因素。本研究結果表明，在VSCC組織中FHIT基因LOH/MSI與HR-HPV感染有關，提示其感染可能是FHIT基因LOH和(或)MSI發生的因素。另外，本研究結果僅反映出FHIT基因片段的LOH和(或)MSI與VSCC的發生有關，不能證實其改變是癌前病變或早期診斷的分子標志物，還是參與VSCC進展的晚期事件，或作為判定患者預后的指標。因此，還有必要擴大樣本量，進一步明確FHIT基因的異常在VSCC中的生物學作用以及與其他因素的關系。

 

(范余娟，蒙亞晴，外陰鱗癌組織中HPV檢測及FHIT基因雜合性缺失、微衛星不穩定性觀察[J]山東醫藥2012年第52卷第2期：21-23)

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