【摘要】目的：研究10種中草藥對(duì)痤瘡致病菌的體外抑菌活性。方法：制備10種中草藥提取物，采用牛津杯抑茵圈法定性檢測(cè)中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性，然后通過(guò)2倍稀釋法定量檢測(cè)其最小抑茵濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：10種中草藥提取物中大黃、黃柏、丁香、姜黃4種中草藥對(duì)兩種致病茵均有抑菌作用；其中大黃的抑茵效果最好，對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度分別為3.125、6.25 mg/mL，最小殺茵濃度分別為6.25、12.50 mg/mL。

【關(guān)鍵詞】中草藥；金黃色葡萄球菌；痤瘡丙酸桿菌；體外抑茵實(shí)驗(yàn)；最小抑菌濃度

痤瘡是一種皮脂腺的慢性皮膚疾病，痤瘡的主要致病菌是痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌，目前抗痤瘡藥物活性評(píng)價(jià)主要考察對(duì)這兩種菌的抑菌作用，減少皮膚毛囊中痤瘡主要致病菌的數(shù)量是祛痘類化妝品的主要途徑之一。

中草藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的中藥組成部分，主要由植物的根、莖、葉、果構(gòu)成。目前我國(guó)各地常使用的藥用植物達(dá)5000種左右，把各種藥材相配伍而形成的方劑，更是數(shù)不勝數(shù)。中草藥價(jià)格低廉，資源豐富，含有多種活性成分，其富含的活性物質(zhì)毒副作用小，在人體皮膚上產(chǎn)生不良反應(yīng)機(jī)會(huì)少。近年來(lái)，安全、綠色、天然的中草藥植物作為祛痘化妝品的主要功效添加劑已成為一種流行趨勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)前，對(duì)國(guó)內(nèi)近20年涉及“中藥”、“外用”、“痤瘡”的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行調(diào)研，選擇10種常見的中草藥作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，即大黃、艾葉、丁香、黃柏、苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳、姜黃，將10種中草藥分別對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)和最小抑菌濃度測(cè)定，旨在篩選抑菌活性強(qiáng)的中草藥，為今后祛痘化妝品開發(fā)中草藥添加劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 大黃、艾葉、丁香、黃柏、苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳、姜黃，購(gòu)于北京同仁堂藥房。

1.2 菌株 痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC11827、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC100817，廣東微生物菌種保藏中心提供。

1.3 儀器 UV2300紫外可見分光光度計(jì)，上海天美有限責(zé)任公司；BS21S精密電子天平，德國(guó)賽多利斯天平有限公司；LS-B50L立式壓力高壓滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁埽�法�?guó)梅利埃公司；Gamma厭氧手套箱，北京迪索儀器有限公司。

1.4 試劑 痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)基：腦心浸液培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌：牛肉膏培養(yǎng)基，均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制，調(diào)pH值為7.1~7.2。將培養(yǎng)基于錐形瓶中密封好后，放入滅菌鍋中于121℃下滅菌30 min，待冷卻后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 中草藥供試液制備將中草藥放入烘箱中，于50%處理12 h，然后分別準(zhǔn)確稱取10 g各中草藥飲片，用粉碎機(jī)粉碎，取干粉1：20的比例溶于200 mL水中，浸泡30 min，然后文火煎煮60 min，靜置至室溫。用200目紗布過(guò)濾取清液，70℃下真空旋蒸濃縮至各濾液濃度為1 g/mL，即得中藥提取液。

2.3 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種培養(yǎng)增菌，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養(yǎng)48 h），吸取菌液用培養(yǎng)基稀釋調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝?/span>（約為1.5×10⁸ CFU/mL），將菌懸液用培養(yǎng)基繼續(xù)稀釋，用麥?zhǔn)媳葷醿x將調(diào)整為1×10⁶~10⁵ CFU/mL，備用。

2.4 抑菌圈測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改良。在無(wú)菌操作條件下，分別取上述菌懸液，用涂布棒均勻涂抹在培養(yǎng)基上。再用無(wú)菌鑷將牛津杯輕放在凝固的培養(yǎng)基表面，輕壓牛津杯使接觸良好。用一次性注射針吸取供試液于牛津杯中，37qC培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養(yǎng)48 h），用卡尺準(zhǔn)確測(cè)量各培養(yǎng)皿中供試液有效抑菌圈的直徑。各樣品重復(fù)3次。另外配制對(duì)照組：空白對(duì)照組（培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（培養(yǎng)基、菌懸液、無(wú)菌水）、陽(yáng)性對(duì)照組（培養(yǎng)基、菌懸液、紅霉素），來(lái)觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基和中草藥對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。

2.5 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用試管2倍稀釋法，測(cè)定各中藥供試液最小抑菌濃度（MIC）。在2.4中對(duì)兩種致病菌均有抑菌效果的中藥供試液用液體培養(yǎng)基依次稀釋10、20、40、80、160、320、640、1280和2560倍。即最終藥液濃度分別為l00 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.5625 mg/mL、0.7825 mg/mL、0.3913 mg/mL。在1 mL的稀釋液中加入0.1 mL的菌懸液。并設(shè)無(wú)藥菌液對(duì)照管、純中藥對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管。37℃培養(yǎng)24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養(yǎng)48 h），觀察結(jié)果。從無(wú)菌生長(zhǎng)的各管中找出最低稀釋液濃度的實(shí)驗(yàn)管，確定MIC。

將在MIC測(cè)定中，未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物中吸取0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養(yǎng)48 h），觀察結(jié)果。以仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的管內(nèi)中藥供試液濃度記為MBC。

3 結(jié)果

體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組培養(yǎng)基澄清，說(shuō)明培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有被污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有干擾。陰性對(duì)照組無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。所選10種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌呈現(xiàn)部分抑制作用，如表l所示。其中大黃和黃柏對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為26.63、21.72 mm，對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑為24.20、19.05 mm，對(duì)兩種菌均有較好的抑制作用；其次是丁香和姜黃對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為17.01、15.75 mm，對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑為18.31、13.62 mm；艾葉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，抑菌直徑為23.19 mm，對(duì)痤瘡丙酸桿菌無(wú)抑菌活性；苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性一般，抑菌直徑分別為l6.52、l5.21、16.81、13.47、16.65 mm，對(duì)痤瘡丙酸桿菌均無(wú)抑菌活性；與陽(yáng)性對(duì)照相比，抑菌活性均相對(duì)較弱。比較而言所選10種中草藥對(duì)金黃的葡萄球菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性。其原因可能與菌種、中草藥種類及其活性成分、濃度、中藥抑菌作用機(jī)制和用藥環(huán)境等有關(guān)。

最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果，通過(guò)2.4抑菌圈實(shí)驗(yàn)篩選出大黃、丁香、黃柏、姜黃4種對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌均有抑制作用的中草藥作為研究對(duì)象。由表2、表3可知，4種中草藥受試液對(duì)兩種痤瘡致病菌的抑制作用程度不同，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌程度依次為大黃3.125 mg/mL、黃柏12.5 mg/mL、姜黃25.0 mg/mL、丁香50.0 mg/mL；對(duì)痤瘡丙酸桿菌抑菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黃50.0 mg/mL。在MIC的測(cè)定基礎(chǔ)上，對(duì)4種中草藥的最小殺菌濃度（MBC）進(jìn)行測(cè)定，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0 mg/mL、姜黃25.0 mg/mL、丁香100.0 mg/mL；對(duì)痤瘡丙酸桿菌殺菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0 mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黃50.0 mg/mL。所以，所測(cè)試的中草藥中，大黃對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌均具有最好的抑菌效果和殺菌效果。

4 討論

痤瘡丙酸桿菌是丙酸桿菌屬的小桿菌，是定居于人類皮膚毛囊皮脂腺濾泡中的最主要的微生物。痤瘡丙酸桿菌能產(chǎn)生很多胞外酶和特異的炎前因子，將皮脂內(nèi)的甘油三脂分解為游離脂肪酸、透明質(zhì)酸酶等，促進(jìn)皮脂分泌，促使金黃色葡萄球菌等繁殖，從而引起炎癥性丘疹、膿皰。痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌與痤瘡發(fā)生的多個(gè)環(huán)節(jié)中都有緊密的關(guān)系，能誘發(fā)或加重痤瘡癥狀，所以，用祛痘類化妝品減少皮膚毛囊中的痤瘡主要致病菌的數(shù)量是目前預(yù)防痤瘡感染和痤瘡患者日常護(hù)膚的主要途徑之一。

本試驗(yàn)選用痤瘡主要致病菌痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌，考察了10種中草藥對(duì)以上兩種致病菌的抑菌活性。結(jié)果表明，10種中草藥提取物通過(guò)抑菌圈法初篩后發(fā)現(xiàn)，只有大黃、丁香、黃柏、姜黃4種中草藥對(duì)兩種菌均有抑菌活性，其中大黃對(duì)金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑分別為26.63、24.20 mm，抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)；在此基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的4種中草藥對(duì)兩種菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）進(jìn)行檢測(cè)，大黃的MIC分別為3.125、6.25 mg/mL，MBC分別為6.25、12.5 mgmL，在4種中草藥中抑菌和殺菌效果相對(duì)最好。

本實(shí)驗(yàn)采用中草藥煎劑測(cè)定其對(duì)痤瘡致病菌的抑菌效果，實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方法簡(jiǎn)便，可以在較短的時(shí)問(wèn)內(nèi)完成大量中草藥的篩選。在試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)各種操作細(xì)節(jié)嚴(yán)格加以控制，定量準(zhǔn)確，故其結(jié)果相對(duì)較為可靠，可作為深入研究的依據(jù)。但是由于本實(shí)驗(yàn)主要研究中草藥的體外抑菌效果，尚缺乏臨床驗(yàn)證，藥物在人體皮膚上的作用機(jī)制比體外相對(duì)復(fù)雜，所以作為祛痘化妝品作用于人體皮膚時(shí)能否達(dá)到與體外相同的效果，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

現(xiàn)代藥理學(xué)的研究證明，許多中草藥都有較好的抑菌、殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)研究以我國(guó)豐富的中草藥為原料，選用的是安全性高并具有清熱解毒之功效的中草藥，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明中草藥對(duì)兩種受試菌具有一定的抑制作用。其臨床應(yīng)用前景樂(lè)觀，值得研究開發(fā)和利用。 

（陳志蓉，董銀卯，孟宏，邳楠，10種中草藥提取物對(duì)痤瘡致病菌的體外抑菌活性研究[J]中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011年第39卷第6期：24-26）

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