老年性癡呆的基因治療與神經(jīng)生長因子

 

    【摘要】 

      基因治療正在成為常規(guī)方法難以治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新的治療手段。本文概要介紹了CNS基因治療的方法和途徑；CNS基因治療的病毒載體以及目前老年性癡呆基因治療研究與神經(jīng)生長因子作用機制的狀況。

 

    老年性癡呆(Alzheimer disease,AD)是德國著名神經(jīng)解剖學(xué)家和病理學(xué)家Alosis  Alzheimer于1907年首先描述,后人以其姓氏命名的。老年性癡呆是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。AD發(fā)病率因調(diào)查的對象、地區(qū)及標(biāo)準(zhǔn)不同而異,但有一個共同的趨勢,就是隨著人口年齡的增大而增多［1］。由于AD病程長,又缺乏有效的治療方法,眾多的AD病人給家庭和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此,尋找有效的AD治療方法已成為醫(yī)學(xué)界的緊迫課題。本文概要介紹了CNS基因治療的方法和途徑；CNS基因治療的病毒載體以及目前老年性癡呆基因治療研究與神經(jīng)生長因子作用機制的狀況。

 

　　1  基因治療

　　基因治療(genetherapy)是向功能缺陷或病變的細(xì)胞及組織引入互補的正常基因或治療性功能基因,使其表達(dá)而達(dá)到治療疾病的方法。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)作為一個高度獨立化器官,因其獨特的生理特征及細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜性,不易進(jìn)行基因操作。近年來,由于神經(jīng)遺傳學(xué)研究的進(jìn)展、CNS疾病發(fā)病機制的進(jìn)一步闡明、導(dǎo)入外源性基因載體的改進(jìn)及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的進(jìn)步,使基因介導(dǎo)CNS疾病的治療越來越趨近現(xiàn)實,CNS作為基因治療的靶器官正逐步實現(xiàn)［2］。

　　1.1  基因治療的方法和途徑

　　1.1.1  exvivo途徑  exvivo途徑即體外細(xì)胞介導(dǎo)法,通過移植攜帶靶基因的工程細(xì)胞完成,是基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和腦內(nèi)移植技術(shù)的結(jié)合。首先將目的基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的靶細(xì)胞內(nèi),進(jìn)行篩選、鑒定后,行體外擴(kuò)增,然后將其移植入腦內(nèi)治療靶區(qū),使其在腦內(nèi)充當(dāng)分泌營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和代謝酶等基因產(chǎn)物的生物學(xué)“微泵”(minipump),此細(xì)胞稱為基因修飾細(xì)胞或工程細(xì)胞。這種方法比較經(jīng)典、安全,效果較易控制,但是存在操作步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大及若采用人類胚胎細(xì)胞則涉及倫理學(xué)問題,故不易推廣。

 

　　exvivo途徑中靶細(xì)胞的篩選是至關(guān)重要的,既要易于獲得、容易轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá),又要避免發(fā)生免疫反應(yīng)。應(yīng)遵循以下原則:(1)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞必須能長期在宿主腦內(nèi)存活,且無侵襲性;(2)修飾后的靶細(xì)胞應(yīng)具有穩(wěn)定表達(dá)治療性產(chǎn)物的能力;(3)可體外控制治療性產(chǎn)物有效、適量的表達(dá);(4)能預(yù)設(shè)某一安全機制,在必要時可激活以阻止修飾細(xì)胞在體內(nèi)有害的生長和(或)有害功能的發(fā)揮,以避免腫瘤發(fā)生。目前,應(yīng)用于CNS基因治療研究的靶細(xì)胞主要有成纖維細(xì)胞、原代骨骼肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎中腦細(xì)胞、條件永生性神經(jīng)細(xì)胞(conditionally immortal izedneural  cell)及神經(jīng)干細(xì)胞。

 

　　1.1.2  invivo途徑  invivo途徑即體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染法,是體內(nèi)基因治療的直接途徑。包括:(1)非病毒介導(dǎo)途徑即通過物理法、化學(xué)法或融合法直接將目的基因?qū)�入體內(nèi)。具有安全、操作簡單、插入容量不受限制及可通過物理方法實現(xiàn)靶向性轉(zhuǎn)移(如基因槍)等優(yōu)點。但是直接導(dǎo)入的DNA通常難以整合入基因組,基因表達(dá)存在不穩(wěn)定性,且在非分裂細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)染效率不高,使其應(yīng)用受到限制。(2)病毒載體介導(dǎo)途徑即通過構(gòu)建復(fù)制缺陷的重組病毒將靶基因引入體內(nèi)。迄今為止,病毒載體用于CNS細(xì)胞基因傳遞取得了許多進(jìn)展,盡管其安全性及效率仍有待提高,但invivo方法已成為目前CNS基因轉(zhuǎn)移的主要研究方向,只有invivo方法取得成功,CNS基因治療才能走向臨床。

 

　　1.2  CNS基因治療的病毒載體

　　1.2.1  RNA病毒載體

　　1.2.1.1  逆轉(zhuǎn)錄病毒載體  逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前研究最成熟的一類RNA病毒載體。常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要來自Moloney小鼠白血病病毒。它具有以下優(yōu)點：宿主范圍廣，能感染包括膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞在內(nèi)的各種分裂細(xì)胞，感染效率高；在正常生理狀態(tài)下可以單拷貝的形式整合入宿主細(xì)胞基因組,并隨宿主細(xì)胞的分裂而增殖；病毒與細(xì)胞結(jié)合后，病毒表面的糖蛋白即結(jié)合于細(xì)胞表面的受體，故細(xì)胞不會被同種病毒重復(fù)感染。但仍存在一些令人擔(dān)憂的問題,如病毒基因組在宿主細(xì)胞染色體上的隨機整合可能引起插入突變；載體在輔助細(xì)胞中有可能發(fā)生同源重組，產(chǎn)生具有致瘤性的野生型病毒；此外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能感染分裂后細(xì)胞，故不能直接用于神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

　　1.2.1.2  慢病毒載體  慢病毒(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,是一類非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,以人類免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus,HIV)為代表。慢病毒源性載體(lentivirus basedvector,LV)最主要的優(yōu)點是它能將外源基因整合入非分裂細(xì)胞的基因組內(nèi),對有絲分裂后神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因治療提供了一個潛在的傳遞系統(tǒng)。但其嚴(yán)格的宿主范圍、滴度低及HIV 1獨特的致病性,限制了它作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。為了最大限度降低其通過重組產(chǎn)生有復(fù)制能力野生病毒的可能性,重組病毒的產(chǎn)生采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng),為了進(jìn)一步增強這一系統(tǒng)的安全性,一種自我失活(selfinactivating,SIN)慢病毒載體最近已被構(gòu)建成功。應(yīng)用LV向腦內(nèi)引入基因已取得了誘人的結(jié)果,轉(zhuǎn)染細(xì)胞(主要為神經(jīng)元)在所有時間點上均明顯高于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,而且這種載體存在長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá),無明顯免疫反應(yīng)。因此LV有可能成為未來CNS基因治療的最佳載體［3.4］。

　　1.2.2  DNA病毒載體

　　1.2.2.1  單純皰疹病毒載體  Ｉ型單純皰疹病毒(herpes simplex virustypel ,HSV 1)含有152kb雙鏈DNA,基因組包含80個以上基因。HSV來源載體有重組子載體(HSV RV)和擴(kuò)增子載體兩大類型。HSV RV含有全部病毒基因組,其中一個或多個基因已突變,以降低其毒性和提供轉(zhuǎn)基因空間。最新版本HSV RV刪除了多個含轉(zhuǎn)錄激活因子的即刻早期基因,基本消除了病毒基因的表達(dá)。HSV 擴(kuò)增子載體由一個含有HSV DNA復(fù)制起點序列oris和包裝信號pac的質(zhì)粒組成。在HSV輔助病毒作用下被允許以串聯(lián)體形式包裝入HSV病毒,無HSV輔助病毒時,這些載體可以通過與一組已刪除HSV基因組保留pac信號序列的粘粒或BAC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而得到包裝。這些載體的優(yōu)點有:基本上無毒性或免疫原性;較大的轉(zhuǎn)基因容量,通常可達(dá)22kb,最大可達(dá)150kb;相當(dāng)高的滴度;對神經(jīng)細(xì)胞的高度感染性,在非分裂細(xì)胞中潛伏達(dá)數(shù)月。此外,HSV載體感染神經(jīng)元時,可沿著神經(jīng)元突起向其胞體快速逆向運輸,故可提供一種間接的靶向性基因轉(zhuǎn)移途徑。但HSV存在神經(jīng)細(xì)胞毒性作用和免疫反應(yīng),可引起較明顯的局部炎癥和壞死,故HSV作為CNS轉(zhuǎn)基因載體還有待于進(jìn)一步研究和改進(jìn)。         

　　1.2.2.2  腺病毒載體  腺病毒(adeno virus,Ad)是目前被較廣泛使用的一類DNA病毒載體,其基因組長約36kb,從左至右可分為4個基因功能區(qū)即E1 E4區(qū)。第一代復(fù)制缺陷型Ad因存在較強的宿主免疫反應(yīng),使其應(yīng)用受到限制。改進(jìn)后的新型Ad載體刪除了表達(dá)病毒蛋白的E2ａ和E4基因或E4基因上特殊的開放性閱讀框,故具有長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和較低的炎癥反應(yīng)。最近產(chǎn)生了一種“無內(nèi)核”(gutless)、高容量的Ad載體,刪除了病毒基因組所有的結(jié)構(gòu)基因,僅保留了復(fù)制和包裝的必需序列。這種“無內(nèi)核”Ad載體具有轉(zhuǎn)基因容量大、滴度高、宿主范圍廣,可感染分裂和非分裂細(xì)胞、感染效率高、無野生腺病毒污染等優(yōu)點,在體研究已顯示其長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性和較低的宿主炎癥反應(yīng)。其另一個特點是具有隨機整合人類或非人類染色體的能力,但整合效率較低,多數(shù)仍以附加子形式存在,而且已整合的載體序列容易發(fā)生重新組合。

　　1.2.2.3  腺相關(guān)病毒載體  腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus,AAV)是一種缺陷型非病原性人類細(xì)小病毒,是目前發(fā)現(xiàn)的最小、結(jié)構(gòu)最簡單的DNA病毒,含有一條線狀單鏈DNA,其復(fù)制依賴于輔助病毒(腺病毒或單純皰疹病毒)。野生型AAV能選擇性整合入人類19號染色體的特定部位,建立溶源性感染。與其它基因載體系統(tǒng)相比較,AAV載體的主要優(yōu)點有:(1)它是一種非病原性的人類病毒,與人類疾病無關(guān)；(2)AAV能感染的細(xì)胞類型范圍較廣,可感染分裂后細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率極高;(3)載體中僅保存AAV的ITRs,而ITRs,基本上又是轉(zhuǎn)錄中性的,不干擾外源基因的表達(dá)和調(diào)控;(4)rAAV缺乏病毒基因,對超感染沒有免疫原性,故可以向同一細(xì)胞引入兩種不同的基因,或?qū)ν�一�?xì)胞反復(fù)感染;(5)轉(zhuǎn)基因可獲得長期穩(wěn)定的表達(dá)。新的包裝技術(shù)已明顯提高rAAV載體滴度,而且可排除輔助腺病毒的污染［5］。此外,可調(diào)控基因表達(dá)載體及針對不同細(xì)胞的靶向性載體的成功開發(fā),使其應(yīng)用前景更加廣泛。

1.2.3  雜交型病毒載體  由于目前的病毒載體系統(tǒng)不能自主復(fù)制,無法達(dá)到穩(wěn)定的CNS轉(zhuǎn)基因表達(dá),而反復(fù)向腦內(nèi)注射載體會給患者帶來較高的危險。為了使CNS轉(zhuǎn)基因獲得長期、穩(wěn)定的表達(dá),根據(jù)現(xiàn)有病毒載體的優(yōu)點,將其不同的病毒元件組合而產(chǎn)生的雜交型病毒載體,目前正在研究、開發(fā),主要包括HSV AAV雜交型擴(kuò)增子載體、Ad EBV和HSV EBV 逆病毒雜交型擴(kuò)增子載體、Ad AAV雜交型載體、Ad 逆病毒雜交型載體等幾種類型。不同載體系統(tǒng)優(yōu)缺點的客觀比較少見文獻(xiàn)報道,目前尚沒有一種載體可以作為所有疾病類型轉(zhuǎn)基因研究的通用工具,而且在以后的數(shù)年內(nèi)也不可能出現(xiàn)這種萬能的載體。在現(xiàn)階段Ad仍可能是以短期表達(dá)為治療目標(biāo)invivo途徑基因研究最合適的載體,特別是那些單次劑量就能達(dá)到臨床治療效果的方案。如能實現(xiàn)Ad靶向性細(xì)胞攝取及表達(dá),降低免疫原性,無疑將擴(kuò)展其用途,但不適合慢性疾病的長期治療。在未來的幾年里,AAV可能是功能缺陷蛋白長期替代治療最常用的載體［6］。

 

　　2  老年性癡呆基因治療概況

　　2.1  老年性癡呆  AD患者腦內(nèi)主要的病理生理改變有兩大特征:第一是皮質(zhì)、海馬及皮質(zhì)下區(qū)等多個部位出現(xiàn)廣泛性的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié);第二是神經(jīng)元變性和丟失及突觸數(shù)量的減少,其中基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性和丟失最為明顯。基底前腦膽堿能神經(jīng)元與AD患者的學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān),因此挽救基底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活和減少其突觸的喪失是治療AD的關(guān)鍵。基底前腦膽堿能神經(jīng)元是神經(jīng)營養(yǎng)因子敏感細(xì)胞,其表面有神經(jīng)營養(yǎng)因子受體,給基底前腦膽堿能神經(jīng)元損害的大鼠腦內(nèi)提供外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,能夠保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免受損害,可以促進(jìn)損傷的神經(jīng)纖維再生長,并且大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力也有明顯的改善［7.8］。

 

　　2.2  老年性癡呆的基因治療  AD基因治療的早期策略是向腦內(nèi)移植遺傳修飾后的能產(chǎn)生NGF的自體同源細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞［9］。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外,還可以通過神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)和替代方法治療AD,膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Cholineacetylase,ChA)是腦內(nèi)乙酰膽堿合成的限速酶,AD患者腦內(nèi)存在ChA活性下降,乙酰膽堿合成減少。轉(zhuǎn)導(dǎo)ChA基因,提高乙酰膽堿合成,可治療AD。最近,Saille等［10］研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)人類抗凋亡基因bcl2的轉(zhuǎn)基因小鼠皮層神經(jīng)元,可明顯抵抗β 淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性損害,提示以抑制神經(jīng)元凋亡為目的的AD神經(jīng)保護(hù)基因治療具有研究潛力。

 

　　越來越多的證據(jù)說明β淀粉樣蛋白(特別是Aβ1-42)在腦內(nèi)沉積是AD早期的主要病理變化。APP、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)的基因突變引起家族性AD,與Ab1-40和總β淀粉樣蛋白相比,Ab1-42相對增加。APP變異的轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的纖維斑塊主要含Aβ1-42,并表現(xiàn)出AD的許多病理學(xué)特點。AD患者腦內(nèi)最初沉積的是Aβ1-42,而不是Aβ1-40。這些都支持淀粉樣蛋白沉積理論,因此抗淀粉樣蛋白治療是治療AD的一種方法。

 

　　2.2.1  Secretase Inhibitors分泌酶抑制劑  APP有α和β兩種裂解方式,Aβ內(nèi)的α分泌酶裂解APP生成非淀粉樣可溶性β APP和Ｃ端APP片段,另一方面,β分泌酶裂解APP的蛋白水解過程,隨后被γ分泌酶裂解,生成Ａｂ片段。γ分泌酶裂解的位置是決定Ａｂ1-42與Ａｂ1-40相對水平的關(guān)鍵因素,Ab1-42開始沉積,神經(jīng)毒性需要Ab的聚集。抑制β和(或)γ分泌酶能夠減少Aβ的產(chǎn)生。現(xiàn)已經(jīng)成功地克隆出一種β分泌酶BACG/Asp2,它可用來研究這些酶的特異性抑制劑。最近研究還發(fā)現(xiàn)presenilins實際上就是γ分泌酶,或是其中的一部分。讓帶有APP的AD轉(zhuǎn)基因鼠口服γ分泌酶抑制劑能降低鼠腦內(nèi)Aβ的水平,但用抑制γ分泌酶抑制劑會減少Notch信號的傳導(dǎo),Notch信號傳導(dǎo)是各種細(xì)胞生長過程中的信號傳導(dǎo)方式［11］。

 

　　2.2.2  抑制tau蛋白的磷酸化  神經(jīng)纖維纏結(jié)中的雙股螺旋狀細(xì)絲的主要成分就是tau蛋白。Ａβ的纖維誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化,使微管失去結(jié)合能力,導(dǎo)致樹突聚集(45)。Aβ還能增加tau蛋白激酶Ｉ、糖原合成酶3β(TPKI/GSK3b)等幾種蛋白激酶的活性,這些酶都能促進(jìn)tau蛋白的磷酸化。這提示Ａβ纖維形成,通過激活GSK3b導(dǎo)致tau蛋白的非正常磷酸化,破壞微管的穩(wěn)定,可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。用GSK3b的反義核苷酸阻斷Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用有可能延緩AD的發(fā)展。最近合成的非ATP、競爭性、選擇性GSK3b抑制劑可避免tau蛋白的過磷酸化,這將是一種治療AD的新途徑［12］。

 

　　2.3  老年性癡呆的基因治療和神經(jīng)生長因子  AD基因治療的早期策略是向腦內(nèi)移植遺傳修飾后能夠產(chǎn)生NGF的神經(jīng)細(xì)胞系，但由于供體－宿主相容性的問題限制了現(xiàn)有神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用。后來有人采用同時腦內(nèi)移植經(jīng)遺傳修飾后能夠產(chǎn)生NGF的3T3成纖維細(xì)胞和胚胎膽堿能神經(jīng)元，結(jié)果有效地促進(jìn)了膽堿能神經(jīng)元的存活，并利用抗膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶染色的方法發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)末梢可向產(chǎn)生NGF的細(xì)胞方向出芽生長。在NGF的作用下，存活的膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿的能力也有所加強。用原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞做工程細(xì)胞也獲得了相似的治療效果，而且發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元軸突向富含NGF的移植物中生長的機制與星狀膠質(zhì)細(xì)胞往移植物中滲透有關(guān)。這些早期的研究留給人們的啟示是:可以利用腦內(nèi)移植經(jīng)遺傳修飾后能夠產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子的工程細(xì)胞的方法達(dá)到治療神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病及神經(jīng)修復(fù)的目的。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外，還可以通過神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)或替代方法治療AD。通過向病變區(qū)導(dǎo)入乙酰膽堿以補充局部神經(jīng)遞質(zhì)的不足有可能促進(jìn)功能的恢復(fù)和改善。另一種方法更為簡易和使用的方法是通過構(gòu)建適當(dāng)?shù)闹亟M基因和表達(dá)載體來制備能夠穿過血腦屏障的融合蛋白，從而達(dá)到從外周非神經(jīng)組織移植細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)向CNS提供具有特殊治療作用的大分子多肽的目的。Friden等報道將NGF和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體相結(jié)合，這一復(fù)合物不僅可以穿過血腦屏障，而且可以促進(jìn)移植的膽堿能神經(jīng)元的存活。  給患者腦內(nèi)提供外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的途徑很多,但基因治療AD一直是近幾年來研究的重要策略［13］。

 

　　基因治療AD一直是多年來研究的重點課題，但是目前還存在許多的問題，基因合成的神經(jīng)營養(yǎng)因子價格昂貴，有待于降低成本提高產(chǎn)量以滿足臨床的需求；轉(zhuǎn)基因治療給AD患者帶來了曙光，在神經(jīng)營養(yǎng)轉(zhuǎn)基因治療AD的研究中，對于BDNF和GDNF的研究尚處于起步階段；而AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元潰變相當(dāng)廣泛，目前轉(zhuǎn)基因治療AD的研究主要是針對一個或幾個腦區(qū)，因此還需要進(jìn)一步的改進(jìn)和探索；另外，目的基因表達(dá)產(chǎn)物在腦內(nèi)的表達(dá)的量和活性的改變以及基因治療的方法還不夠成熟等等還需進(jìn)一步的研究和探索［13］。

 

　　可以預(yù)見，隨著人類基因組計劃的完成。AD的發(fā)病機制的進(jìn)一步闡明，有效治療的靶基因的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入外源性基因載體的改進(jìn)及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的改進(jìn)，基因表達(dá)產(chǎn)物在腦內(nèi)的表達(dá)的量和活性的控制技術(shù)不斷成熟，基因治療必將成為治療AD的新的強有力的手段［14］。

 

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