類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫病。其發(fā)病機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，具有自身反應(yīng)性的T細(xì)胞，如Th1細(xì)胞進(jìn)而Th17細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用，他們聚集到異常增生的滑膜組組，導(dǎo)致長期的關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞。相比之下，具有可以抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞過度增值功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在RA患者中存在缺陷，進(jìn)一步導(dǎo)致了機(jī)體免疫平衡的失調(diào)。近年來，生物制劑腫瘤壞死因子（TNF）- 拮抗劑成為治療RA療效確切的藥物之一，但其緩解病情的內(nèi)在機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在通過探討重組抗（TNF）- 人鼠簽合單克隆抗體（anti-TNF rcMAb）對(duì)RA患者外周血Th1、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及他們相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet、維甲酸相關(guān)孤核受體（ROR）C、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）的影響，以期發(fā)現(xiàn)TNF- 拮抗劑治療方案的作用機(jī)制。

    1 對(duì)象與方法
    1.1 研究對(duì)象
    所有參與研究的患者均使用由中信國健藥業(yè)有限公司研制anti-TNF rcMAb。而次研究是由中信國健藥業(yè)有限公司2008年發(fā)起的以單用甲氨蝶呤為對(duì)照，平價(jià)注射用anti-TNF rcMAb聯(lián)合甲氨蝶呤RA的有效性和安全性的隨機(jī)、雙盲、多中心臨床試驗(yàn)的一部分。本中心患者，共50例，男性7例，女性43例，年齡19~63歲，平均（46±12）歲。

    1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)
    所有病例均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，且篩選時(shí)病情處于活動(dòng)期；使用甲氨蝶呤治療至少3個(gè)月，且劑量穩(wěn)定在7.5~15mg/周，至少已4周；如正使用非甾體抗炎藥（NSAIDs），則劑量至少穩(wěn)定一周；若篩選時(shí)未使用NSAIDs，則至少1周未用；若正口服糖皮質(zhì)激素，則劑量必須穩(wěn)定在≤10mg/d（相當(dāng)于波尼松劑量）至少4周；曾使用過1種或1種以上改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）治療失敗，但篩選前4周內(nèi)已經(jīng)停用甲氨蝶呤以外的DMARDs（包括但不限于：氯喹、羥氯喹、金制劑、青霉胺、柳氮黃吡啶、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A、來氟米特、金諾分、雷公藤多苷等）。年齡18~65歲男女不限。

    1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)
    過敏體質(zhì)或已知對(duì)人免疫球蛋白過敏或?qū)�anti-TNF rcMAb成分過敏；關(guān)節(jié)功能狀態(tài)處于Ⅳ級(jí)或關(guān)節(jié)X征象處于Ⅳ級(jí)；篩選前4周內(nèi)接種過活（減毒）病毒/細(xì)菌疫苗，或使用過治療RA的中草藥；篩選時(shí)正在參加其他臨床試驗(yàn)；篩選前3個(gè)月內(nèi)使用過任何生物制劑（如：依那西普、英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、利妥昔單抗等）；現(xiàn)患或曾有過活動(dòng)性結(jié)核病史；篩選前6個(gè)月內(nèi)曾有過嚴(yán)重的感染或正處于急性感染或慢性感染反復(fù)發(fā)作期；篩選前6個(gè)月內(nèi)曾有過機(jī)會(huì)性感染；有人工關(guān)節(jié)感染史，或有可疑人工關(guān)節(jié)感染已經(jīng)接受過抗生素治療且該人工關(guān)節(jié)未切除；篩選前3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過器官移植手術(shù)；現(xiàn)患者曾有過全身性自身免疫病，其癥狀和體征預(yù)期會(huì)影響對(duì)試驗(yàn)藥物的評(píng)價(jià)。

    按照程序在研究開始前，由上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)理論委員會(huì)討論認(rèn)為本研究符合人體試驗(yàn)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到院理論委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試對(duì)象在篩選前均簽署知情同意書。

    1.4 分組情況
    所有患者均為風(fēng)濕科門診患者，且均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。由統(tǒng)計(jì)學(xué)專家使用SAS8.0軟件包隨機(jī)數(shù)字生成器生成隨機(jī)數(shù)字表并制定隨機(jī)卡片，按照隨機(jī)卡片由計(jì)算機(jī)產(chǎn)生序號(hào)、隨機(jī)數(shù)及分組數(shù)，制成隨機(jī)卡裝信封備用。合格受試者按進(jìn)入臨床的先后順序，拆開號(hào)碼相同的信封，按信封內(nèi)卡片規(guī)定的分組進(jìn)行治療。由此隨機(jī)分為2組：①聯(lián)合治療組（甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb）：40例，其中男性3例，女性37例，年齡23~63歲，平均（46±11）歲；②對(duì)照組（甲氨蝶呤+安慰劑）10例，其中男性4例，女性6例，年齡19~59歲，平均（47±12）歲。

    1.5 給藥方法
    符合入組標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)的RA患者由計(jì)算機(jī)程序按隨機(jī)分配原則分為2組。聯(lián)合治療患者接受anti-TNF rcMAb（3mg/kg）+甲氨蝶呤治療；對(duì)照組患者接受甲氨蝶呤單獨(dú)治療，分別于0、2、6、14周給藥。

    1.6 外周血Th1、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)
    1.6.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的制備：肝素抗凝靜脈血與等體積RPMI 1640培養(yǎng)液充分混勻，用巴氏滴管將稀釋的血液輕輕加于淋巴細(xì)胞分離液Ficoll（勿擾亂液面），離心2000r/min，20min。離心后管內(nèi)分為3層：上層為血漿和RPMI 1640培養(yǎng)液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，單個(gè)核細(xì)胞層分為白色絮狀，位于上、中層頁面交界處。小心吸出單個(gè)細(xì)胞層，至另一離心管中，加RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌，離心1500r/min，10min，去上清，重復(fù)1次，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，待用。
    1.6.2流式細(xì)胞染色：對(duì)于胞內(nèi)染色，PBMCs首選必須用聚丙烯酸甲酯（PMA）（50ng/ml）、羅紅霉素（500ng/ml）和高爾基體抑制劑（ColgiPlug）刺激5h。表面染色時(shí)，加入熒光標(biāo)記的表面抗體人CD4-多甲澡葉綠素蛋白（Percp）-Cy5.5（BD Pharmingen），4℃，避光孵育30min。洗滌后，用破膜固定液固定，4℃，避光孵育20min，胞內(nèi)染色時(shí)，用抗人白細(xì)胞介素（IL）-17-澡紅蛋白（eBioscience）和抗人IFN- -別澡青蛋白（APC，BD Pharmingen）染Th17和Th1細(xì)胞。

    進(jìn)行調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色檢測(cè)時(shí)，表面染色用抗人CD4- Percp-Cy5.5（BD Pharmingen）和抗人CD25-澡紅蛋白（Miltenyi Biotec）染CD4和CD25分子，用Cytofix/Cytoperm緩沖液試劑盒（eBioscience）4℃、避光孵育30min，進(jìn)行破膜固定，然后用抗人Foxp3-異硫氰酸熒光素（FITC）（eBioscience）4℃、避光孵育60min進(jìn)行Foxp3染色。
所有染色樣本均由FACS Calibur流式細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，流式數(shù)據(jù)均用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

    1.6.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)：RNA抽提：使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）抽提RNA，具體步驟：取（1~5）× 的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次；加入含1% 2-ME的RIT裂解液350µl，反復(fù)吹打裂解；加入等體積70%乙醇混勻；吸出樣品上柱，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，加RW1洗液350µl，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，用RNeasy-free DNase試劑盒（Qiagen），加DNaseI（10µl+70µl緩沖液）76~80µl，室溫作用15min，去除DNA；加RW1洗液359µl，室溫離心（12000r/min，15s）；更換新的收集管，加RPE洗液（含乙醇）500µl，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，室溫離心（12000r/min，2min）；棄收集管中液體，換RNeasy-free的1.5倍離心管作為收集管，加RNeasy free水30µl，離心（12000r/min，1min），收集RNA；吸光度 定量，計(jì)算RNA濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?

    cDNA合成：使用Sensiscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應(yīng)體系為總體積：20µl/管（10×buffer 2µl，Dntp Mix（5mmol/L）2µl，隨機(jī)引物（50ng/µl）1µl，Sensiscriptnt逆轉(zhuǎn)錄酶1µl，RNA酶抑制劑（10U/µl）1µl，RNA<50ng，無RNA酶水補(bǔ)充至20µl。反應(yīng)條件：37℃1h；93℃5min；4℃維持。完成逆轉(zhuǎn)后，-20保存?zhèn)溆谩?
   

    引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用PrimerEspress軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并用基本區(qū)域比對(duì)搜索工具（BLAST）進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。所引用的引物序列如下：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）：上游引物5′-GT-GAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3′；RORC：上游引物5′-CGGGCCTACAATGCTGACA-3′，下游引物5′-GCC-ACCGT-ATTTGCCTTCAA-3′;T-bet：上游引物5′-GCCTACCAGAATG-CCGAGATTA-3′，下游引物5′-TCAAAGTTCTCCCGGAATCCT-3′;Foxp3:上游引物5′-CGGACCATCTTCTGGATG-AG-3′,下游引物5′-TTGTCGGATG-ATGCCACAG-3′。
實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加雙蒸水4倍稀釋，用熒光染料SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）5µl，與目的基因引物或內(nèi)參引物0.15µl混勻，短暫離心。反應(yīng)體系：總體積：10µl/孔（2×SYBR Green Master Mix 5µl，引物（5µmol/L）0.15µl，cDNA（去離子水5倍稀釋）4.85µl），加樣，三復(fù)孔，加密封膜。實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)，程序如下：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；后兩步驟，作40個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的Ct（threshold cycle）值，計(jì)算出樣本基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.7 療效觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)指標(biāo) 
    1.7.1 臨床指標(biāo)：晨僵持續(xù)時(shí)間；關(guān)節(jié)腫脹計(jì)數(shù)；關(guān)節(jié)觸痛計(jì)數(shù)；疼痛程度；健康評(píng)估問卷（HAQ）;患者對(duì)自我疾病總體狀況的評(píng)估；醫(yī)生對(duì)患者疾病總體狀況的評(píng)估。 
    1.7.2 理化指標(biāo)：紅細(xì)胞沉降率（ESR）；C反應(yīng)蛋白（CRP）；類風(fēng)濕因子（RF）；抗核抗體；Th1、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；雙手（含腕關(guān)節(jié)X線）。 
    1.7.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)：采用美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)所指定的標(biāo)準(zhǔn)ACR20、ACR50、ACR70來評(píng)價(jià)療效。 

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 
    采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用 檢驗(yàn)或Ridit分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 

    2 結(jié)果 
    2.1 患者基本情況和基本特征：患者的人口學(xué)特征和疾病情況。所有入選患者病程均屬于活動(dòng)期中重度，70%以上患者RF呈陽性，平均病程4~6年。聯(lián)合治療組和對(duì)組組臨床及實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)的基線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些指標(biāo)進(jìn)一步說明患者具有中度或重度RA癥狀。2組治療前一般情況及各療效指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有較好的可比性。在14周的療程中，聯(lián)合治療組的脫落率為7.5%，對(duì)照組的脫落率為10%。2組脫落的主要原因是過敏反應(yīng)、肝功能損害、血小板低于等不良反應(yīng)。 
    2.2 2組有效率比較：經(jīng)過Ridit分析，2組的ACR療效比較在治療后2周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 
    2.3 2組聯(lián)合治療前后對(duì)Th1、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響：Th17細(xì)胞在對(duì)照組中有所上升，在聯(lián)合治療組中無明顯變化；在聯(lián)合治療組中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯升高，差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 
    2.4 2組聯(lián)合治療前后對(duì)Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的影響：治療前，聯(lián)合治療組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩組具有可比性；無論是在聯(lián)合治療組還是對(duì)照組，Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)量均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 

    3 討論 
    RA是一種以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、侵蝕性自身免疫病。其核心是滑膜和骨的侵蝕和破壞。RA的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。最近認(rèn)為，TNF- 和白細(xì)胞介素（IL）-1在其發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用，并最終導(dǎo)致滑膜和關(guān)節(jié)軟骨的損傷，阻斷這些細(xì)胞因子的通路，可減輕炎癥及關(guān)節(jié)破壞，有效緩解RA病情。 

    致病性炎癥細(xì)胞Th17、Th1細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的失衡是引起RA發(fā)病及滑膜炎癥、骨破壞的機(jī)制之一。Th17細(xì)胞于2005年被定義為新的Th細(xì)胞亞群，分泌促炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22，亦可分泌TNF- 和IL-6等，在自身免疫病和抗染色免疫中扮演了重要角色。Sakaguchi等在胸腺中分離得到一群高表達(dá)CD25的CD4單陽性T細(xì)胞，將其稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在健康人和小鼠外周血和脾臟CD T細(xì)胞中占5%~10%。Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子可抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的過度增殖，在維持機(jī)體的免疫平衡、促進(jìn)免疫耐受、預(yù)防和控制自身免疫疾病中起著重要的作用。RORC是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)其功能的特異性轉(zhuǎn)錄因子。有關(guān)Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的研究揭示了RA發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)之一。 

    經(jīng)過我們18周隨機(jī)雙盲對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療比單用甲氨蝶呤治療療程癥狀改善更為明顯，6周的ACR20有效率已經(jīng)超過50%，ACR50、ACR70的有效率明顯高于對(duì)照組，甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb聯(lián)合用藥起效快，作用強(qiáng)度優(yōu)于單用甲氨蝶呤的對(duì)照組。 

    同時(shí)，通過對(duì)患者治療前后的外周血輔助性T細(xì)胞亞群變化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合治療組Th1細(xì)胞比例在第18周時(shí)有所下降，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯上升，Th17細(xì)胞比例幾乎無變化；在對(duì)照組中，Th1和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也相應(yīng)降低和升高，但Th17細(xì)胞較第0周略有上升。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各亞群細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，Th17、Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子RPRC、T-bet表達(dá)在2組中均降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)均升高。 

    anti-TNF rcMAb與可溶性的TNF- 有很高的親和力，能有效地減輕患者的癥狀和降低疾病的活動(dòng)度，如關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、晨僵的改善及ESR，C反應(yīng)蛋白的下降。在其他自身免疫病，如強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病、銀屑病等的治療中療效也很好。研究發(fā)現(xiàn)，TNF可下調(diào)Foxp3的表達(dá)，從而抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，本研究中證實(shí)，經(jīng)過TNF- 抗體治療后的患者，臨床癥狀得到明顯改善，患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例明顯上升，Th1細(xì)胞的比例有所下降，其作用機(jī)制可能通過提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，進(jìn)一步抑制Th1等炎癥細(xì)胞。 

    綜上所述，anti-TNF rcMAb聯(lián)合甲氨蝶呤用藥，可影響患者外周血Th17、Th1、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的比例，對(duì)RA患者病情的改善起到一定的作用，這與陳俊偉等報(bào)道結(jié)果類似。通過本研究對(duì)RA免疫應(yīng)答失衡機(jī)制有了更為深刻的了解。我們將進(jìn)一步研究其對(duì)各群細(xì)胞功能的影響，以期進(jìn)一步揭示anti-TNF rcMAb對(duì)控制RA病情的內(nèi)在機(jī)制。

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