引起病毒性肝炎的病原體主要是肝炎病毒，包括甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV），近年來(lái)的研究表明，GB病毒（GBV）/庚型肝炎病毒（HGV）和輸血傳播病毒（TTV）。最近報(bào)導(dǎo)國(guó)外發(fā)現(xiàn)了SEN病毒（SENV），可能是解釋目前仍有10~15%的病毒性肝炎患者病原學(xué)不清的問(wèn)題。無(wú)論是那一種肝炎病毒感染引起的急性、慢性病毒性肝炎，根本原因是病毒復(fù)制和表達(dá)的存在，病毒的抗原誘發(fā)機(jī)體的免疫原理反應(yīng)，造成肝臟炎癥損害。因此，要從根本上解決病毒性肝炎的問(wèn)題，從基因水平上，尋求阻斷、抑制、甚至是清除肝炎病毒，是非常重要的思路。基因治療是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

 

　　一、 基因治療的概念和策略

 

　　基因治療就是用正常或野生型基因校正或轉(zhuǎn)換缺陷或致病基因的一種分子生物學(xué)水平的治療方法。傳統(tǒng)意義上的基因治療（gene therapy），是指目的基因?qū)�入靶�?xì)胞以后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合，成為宿營(yíng)主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起到對(duì)疾病的治療作用。近些年來(lái)，采用某些基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，即使目的的基因和宿營(yíng)主細(xì)胞的基因不發(fā)生整合，目的基因也可得到暫時(shí)表達(dá)。目的基因的表達(dá)產(chǎn)物也具有一定的治療作用。這種基因治療中應(yīng)用的目的基因應(yīng)象我們平常在臨床上使用的藥物一樣。為了與傳統(tǒng)意義上的基因治療相區(qū)別，這種目的基因不與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合，暫時(shí)表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法（gene therapeutics）。

 

　　基因治療中根據(jù)針對(duì)宿主病變細(xì)胞基因采取的措施不同，又分為基因轉(zhuǎn)換（gene replacement），基因修正（gene correction），基因修飾（gene augmentation），基因滅活（gene inactivation）和基因疫苗（gene vaccine）等五大策略。基因滅活和基因疫苗是阻斷和抑制肝炎病毒基因復(fù)制和表達(dá)的重要基因治療手段。基因治療的條件包括：目的基因的獲得，靶細(xì)胞的選擇以將目的基因?qū)�入窠主�?xì)胞基因轉(zhuǎn)移的高效手段。基因治療的步驟包括：目的基因的準(zhǔn)備、受體細(xì)胞的培養(yǎng)、載體的選擇、將目的基因?qū)�入到靶�?xì)胞等。

 

　　二、 病毒性肝炎的基因治療

 

　　基因治療在抗腫瘤，遺傳性疾病和傳染病的治療中有十分重要的應(yīng)用前景，近年來(lái)的研究表明，基因治療在病毒性肝炎的治療中也能發(fā)揮重要的影響。病毒性肝炎的基因治療研究雖然取得了一系列的進(jìn)展，但是，由于病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有完全了解清楚，目前基因治療在病毒性肝炎治療中的應(yīng)用遠(yuǎn)未達(dá)到最高水平。病毒性肝炎的基因治療一方面取決于基因治療技術(shù)本身發(fā)展的速度和狀態(tài)，另一方面也取決于病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制本身研究的深入程度。

 

　　（一） 淋巴因子轉(zhuǎn)基因表達(dá)

 

　　淋巴因子在傳染病治療中具有十分重要的作用和廣泛的應(yīng)用前景。其中的干擾素（IFN）已成為目前抗肝炎病毒治療唯一公認(rèn)有效的基因工程藥物。利用淋巴基因表達(dá)進(jìn)行傳染病的基因治療研究，是基因治療在傳染病中的一個(gè)重要應(yīng)用和重要的研究方向。

 

　　1、 干擾素的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)

 

　　Seif等將小鼠的干擾素β（IFNβ）的基因置于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的啟動(dòng)子序列的控制之下，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Babl/c小鼠的成纖維細(xì)胞系NIH3T3，得到了持續(xù)的IFNβ的表達(dá)。表達(dá)IFNβ的細(xì)胞系，對(duì)濾泡口炎病毒（VSV，vesicular stomatitis virus），腦心肌炎病毒（EMCV，encephalomy-ocarditis virus）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的復(fù)制和表達(dá)均有明顯的抑制作用。并發(fā)現(xiàn)持續(xù)低水平的IFNβ的分泌表達(dá)，就可以使這一細(xì)胞系產(chǎn)生明顯的抗病毒狀態(tài)。然而，用等量的外源重組的IFNβ則無(wú)此效果。而且，加入相應(yīng)的IFNβ的單克隆抗體并不能阻斷這種轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系對(duì)上述三種病毒的抑制效應(yīng)。因此認(rèn)為，此細(xì)胞系的抗病毒狀態(tài)的產(chǎn)生，除了和分泌型IFNβ的表達(dá)有關(guān)以外，還有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik等將人的α2干擾素（IFNα2）的基因重組到人免疫缺陷病毒（HIV）的長(zhǎng)未端重復(fù)序列（LTR）中的啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)入非洲綠腎細(xì)胞系中，IFNα2的分泌表達(dá)水平持續(xù)在50~150u/ml之間。這一低水平的IFNα2的表達(dá)完全可以抑制HIV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。同樣地也發(fā)現(xiàn)就用相應(yīng)水平的外源重組的IFNα2也無(wú)此效果。而且IFNα2的單抗也不能阻斷IFNα2的抗病毒作用。這一差別的原因，作者認(rèn)為體內(nèi)產(chǎn)生的IFNα2與體外重組的IFNα2的抗病毒機(jī)理不同。外源重組的IFNα2的抗病毒機(jī)理，是抑制HIV的成熟和裝配過(guò)程，而內(nèi)源表達(dá)的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在轉(zhuǎn)錄水平以及HIV mRNA的穩(wěn)定性等方面。

 

　　2、 白細(xì)胞介素-2的轉(zhuǎn)基因表達(dá)

 

　　Guidotti等應(yīng)用HBV DNA轉(zhuǎn)基因小鼠，證實(shí)IL-2對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)錄的2.1kb的mRNA具有明顯的抑制作用。認(rèn)為IL-2對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)錄2.1kb mRNA的啟動(dòng)子活性有明顯的負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)，還通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）和γ干擾素（IFNγ）的誘生達(dá)到抗病毒的效果。因?yàn)楦渭?xì)胞膜上沒(méi)有IL-2的受體，所以認(rèn)為IL-2的抗病毒作用是其對(duì)HBV DNA啟動(dòng)子活性的直接抑制使用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。并且認(rèn)為IL-2抑制HBV DNA的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)生的。

 

　　（二） 寡腺苷酸合成酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)

 

　　Chebath 等構(gòu)建了2''''-5''''AS的真核表達(dá)載體，和作為標(biāo)志基因的二氫葉酸還原酶（dhfr）基因的表達(dá)載體以共轉(zhuǎn)染的方式，導(dǎo)入到中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞（CHO）中，得到了2''''-5''''AS的表達(dá)。這一轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系和其親本細(xì)胞相比較，具有顯著的抗小RNA病毒的能力，如門果病毒（mengovirus）等的感染。這一研究結(jié)果表明，表達(dá)2''''-5'''' AS的細(xì)胞系可以繞過(guò)IFN的誘生，僅僅靠2''''-5'''' AS的表達(dá)也能產(chǎn)生顯著的抗病毒效應(yīng)。這種2''''-5'''' AS誘生在IFN抗病毒治療中是有普遍意義的。因此，這是一個(gè)很有價(jià)值的探索方向。

 

　　（三） 病毒抗原編碼基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)

 

　　Felgner等首先將HIV的糖蛋白gp120的基因與巨細(xì)胞病毒（CMV）的即刻早期（IF,immediate early）啟動(dòng)子序列重組，構(gòu)建了表達(dá)gp120的重組表達(dá)載體。將這種重組表達(dá)載體的質(zhì)鑿DNA進(jìn)行肌肉注射，一部分細(xì)胞可獲得這種DNA而進(jìn)行表達(dá)gp120。作為一種抗原，機(jī)體可以產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體。這種特異性的免疫應(yīng)答是防治HIV的重要途徑之一。Morin等也得到類似的結(jié)果。

 

　　（四） 保護(hù)性抗體的基因?qū)�入與表達(dá)

 

　　HIV感染CD4+細(xì)胞并使其破壞，造成CD4+細(xì)胞的數(shù)量減少，甚至完全喪失。以至于與之相關(guān)的免疫功能缺陷。保護(hù)CD4+細(xì)胞不受感染，其中的一種策略就是利用基因治療技術(shù)導(dǎo)入HIV-1抗體的基因進(jìn)行表達(dá)，中和HIV的感染性，Marasco等導(dǎo)入了針對(duì)HIV-1的單鏈抗體基因，可以特異性地與HIV-1的包膜糖蛋白相結(jié)合，以抑制或阻斷HIV的感染能力。以HIV的cDNA的單鏈抗體的編碼基因共轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞中，其中HIV表達(dá)其核心蛋白（gag）的水平變化不大，但產(chǎn)生具有感染能力的HIV病毒顆粒的數(shù)量卻顯著降低。最近，Pomerantz等研究資料表明，抗Rev的單鏈抗體的表達(dá)，在細(xì)胞漿中可以捕獲Rev蛋白，并且可以抑制HIV的表達(dá)。提示以HIV抗體的編碼基因作為目的基因進(jìn)行抗病毒基因治療，是一個(gè)有希望的途徑。但是，HIV可以編碼多種結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白，作為抗原可以引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生不同的抗體，為了優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)抗體的表達(dá)，抗HIV感染的基因治療的策略，必須對(duì)各種可能的抗體抑制或阻斷HIV感染的效果進(jìn)行比較，以獲得較為理想的基因治療效果。

 

　　（五） 阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程

 

　　HIV感染并進(jìn)入宿主細(xì)胞，必需借助其包膜糖蛋白pg120與宿主淋巴細(xì)胞膜上的CD4抗原相結(jié)合，這也是HIV選擇下破壞CD4+細(xì)胞的重要原因。因此以過(guò)量的CD4抗原分子和HIV的包膜糖蛋白gp120，就可以阻斷和抑制HIV的感染能力。由此保護(hù)未受感染的CD4+細(xì)胞。只要保證CD4+細(xì)胞的合適數(shù)量，HIV感染者就不會(huì)發(fā)展成嚴(yán)重的免疫缺陷，招致嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染。Fischer等均可溶性CD4+（sCD4）分子的編碼基因?qū)�入到體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞中，sCD4分子確實(shí)可以阻斷HIV-1的感染。免疫系統(tǒng)中CD4分子的正常功能與主要組織相容性復(fù)合體（MHC Ⅱ）型分子的免疫識(shí)別密切相關(guān)。因此，應(yīng)用這種sCD4分子干擾HIV-1與CD4+細(xì)胞結(jié)合來(lái)進(jìn)行抗病毒基因治療，擔(dān)心會(huì)干擾MHC Ⅱ特異性T細(xì)胞的功能。轉(zhuǎn)基因小鼠的研究結(jié)果表明，這種擔(dān)心實(shí)際上是沒(méi)有根據(jù)的。Weber等建立了表達(dá)sCD4分子的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，持續(xù)表達(dá)sCD4分子達(dá)100ug/ml，但如此高水平的sCD4分子的表達(dá)，并沒(méi)有影響小鼠CD4+細(xì)胞對(duì)同各異型抗原或抗-CD3抗體刺激的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答。

 

　　另外，輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)抗體的應(yīng)答機(jī)制，也不受sCD4分子過(guò)表達(dá)的影響。Morgan等曾應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體-包裝細(xì)胞系基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將sCD4的編碼基因?qū)�入到人T淋巴細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，可以明顯抑制HIV-1的感染。最近，sCD4與免疫球蛋白融合基因的表達(dá)，也獲得了明顯的抗HIV-1的效果。但是，以sCD4基因作為目的的基因的抗HIV-1基因治療I期臨床實(shí)驗(yàn)卻未取得預(yù)期的成功。從臨床標(biāo)本中分離到了抗sCD4分子的抗性HIV-1病毒株，從一個(gè)側(cè)面解釋了其中的一個(gè)原因。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中和sCD4抗性株所需要的sCD分子數(shù)是sCD4敏感株的200-2700倍。因此，考慮到利用sCD4編碼基因作為目的基因進(jìn)行抗病毒基因治療時(shí)，必須考慮到基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)調(diào)控的技術(shù)之外，還要考慮到sCD4分子本身的一些性質(zhì)和特點(diǎn)。

 

　　近年來(lái)，有關(guān)HIV-1感染的發(fā)病機(jī)制研究領(lǐng)域中最為令人興奮的發(fā)現(xiàn)之一就是HIV-1感染，必須借助輔助分子（cofactor）融合素（fusin），即CC CKR5這種趨化因子受體的參與。因?yàn)镠IV-1不僅可以高效地感染CD4-細(xì)胞系，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染等，而且，將CD4分子的編碼基因轉(zhuǎn)染CD4-的細(xì)胞系，使其表型由CD4-變?yōu)镃D4+，也不能導(dǎo)致其對(duì)HIV-1感染的敏感性增加。最后也想到了輔助分子的可能性。為此，各國(guó)科學(xué)家為之奮斗了整整8個(gè)春秋，才從眾多的候選分子中確認(rèn)融合素是HIV感染宿主細(xì)胞的必須結(jié)合的輔助分子。這一重要發(fā)現(xiàn)，必須會(huì)導(dǎo)致抗HIV感染新療法的出現(xiàn)。針對(duì)融合素分子抗體的基因治療以及融合素基因特異性的核酶（ribozyme）的分子設(shè)計(jì)，將是抑制或阻斷HIV感染靶細(xì)胞的基因治療手段。

 

　　關(guān)于HBV的受體一直認(rèn)為PHSA-R是HBV感染靶細(xì)胞的受體分子，但這種觀點(diǎn)也存在嚴(yán)重的不足。最近的研究結(jié)果表明，附加素V（annexin）可能是HBV感染靶細(xì)胞的另一個(gè)受體分子。關(guān)于HCV受體的研究，發(fā)現(xiàn)CD81這種跨膜分子，可能是HCV感染靶細(xì)胞的受體分子。根據(jù)肝炎病毒的受體分子的性質(zhì)，可能是探索抗肝炎病毒治療方法的重要思路，但目前還沒(méi)有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

 

　　（六）、細(xì)胞內(nèi)免疫

 

　　Malim等根據(jù)HIV-1的反式激活Rev蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了抗HIV-1基因治療的細(xì)胞內(nèi)免疫策略。Rev蛋白富含亮氨酸的羧基未端是其反式作用的絕對(duì)依賴區(qū)。此區(qū)的突變體作為野生型Rev蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子，對(duì)未剪切的單剪切的HIV RNA的表達(dá)的穩(wěn)定性都有顯著的影響。將HIV Rev氨基酸序列中78位（L-D）和79位（E-L）進(jìn)行定點(diǎn)誘變，則形成突變體Rev M10。此突變體保持了野生型Rev與Rev應(yīng)答元件（RRE）結(jié)合的能力，卻沒(méi)有任何激活功能。以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-包裝細(xì)胞系基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將編碼Rev M10的基因?qū)�入到人T細(xì)胞系中以后，穩(wěn)定表達(dá)Rev M10的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可以顯著抵抗HIV-1的感染，并在人的外周血T淋巴細(xì)胞中得到重復(fù)。另外，將病毒基因特異性核酶的編碼基因?qū)�入到T細(xì)胞之中，也能使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)這種病毒的細(xì)胞內(nèi)免疫狀態(tài)。利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到的肝炎病毒特異性單鏈可變區(qū)抗體可能是進(jìn)行抗肝炎病毒細(xì)胞內(nèi)免疫基因治療的重要研究方向。

 

　　（七）、誘餌設(shè)計(jì)

 

　　病毒基因的分子生物學(xué)研究為抗病毒基因治療提供了新的設(shè)計(jì)思路。如人免疫缺陷病毒（HIV）基因調(diào)控存在著極為復(fù)雜的順式和反工調(diào)節(jié)機(jī)制，這些調(diào)節(jié)機(jī)制已成為設(shè)計(jì)抗病毒基因治療方案的重要依據(jù)。HIV反式調(diào)節(jié)（trans regulation），即某些反式激活劑（transactivator）與HIV RNA的相應(yīng)靶位結(jié)合，與HIV基因組復(fù)制和表達(dá)有著極為密切的關(guān)系。因此，可以設(shè)計(jì)一種基因，其轉(zhuǎn)錄物與HIV RNA競(jìng)爭(zhēng)性地反式激話相結(jié)合，HIV RNA沒(méi)有足夠的反式激話劑的結(jié)合與刺激，就不能進(jìn)行有效的復(fù)制和表達(dá)。與HIV RNA競(jìng)爭(zhēng)性與反式激活劑引結(jié)合的RNA片段，稱為誘餌（decoy）分子。

 

　　誘餌RNA分子表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和基因治療是抑制HIV復(fù)制和表達(dá)的重要策略。誘餌方案的設(shè)計(jì)和應(yīng)用尋求病毒核酸與反式激活劑的分離，這就要求誘餌分子要處于量的優(yōu)勢(shì)。即必須處于"過(guò)表達(dá)（overexpression）"狀態(tài)。只有如此，才能有足夠的誘餌分子與HIV RNA競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合反式激活劑。針對(duì)HIV來(lái)說(shuō)，誘餌設(shè)計(jì)最為常用的基因片段為Tat和Rev等。Gilboa等將HIV-1的Tat和Rev 的兩斷基因分別插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在內(nèi)源性polⅢ（tRNAmet）啟動(dòng)子系列的控制之下進(jìn)行表達(dá)，可抑制CEM細(xì)胞中HIV的復(fù)制和表達(dá)。為了提高誘餌的表達(dá)水平及抗病毒作用，可將多個(gè)誘餌的編碼基因頭尾串聯(lián)在一起，這樣可提高表達(dá)的誘餌的分子數(shù)，提高其抗病毒的作用。

 

　　病毒基因的反式調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅是設(shè)計(jì)抗病毒基因治療直接的理論根據(jù)，而且還為提高目的基因的表達(dá)水平提供了有效的手段。Bednarick等將人的IFN基因重組在HIV-1 LTR中的啟動(dòng)子系列的下游，轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞以后，其分泌IFN的水平僅在50~150u/ml之間。如果向此表達(dá)系統(tǒng)中提供LTR中的啟動(dòng)子的反試激活劑tst蛋白，受到反式激活以后，可使IFN的表達(dá)水平提高到103u/ml。目前基因治療研究領(lǐng)域中，基因的表達(dá)水平不高，妨礙了基因治療技術(shù)發(fā)揮更好的作用，這一機(jī)制是很有意義的。不僅細(xì)胞因子的表達(dá)水平可應(yīng)用這一策略進(jìn)行提高，誘餌分子的表達(dá)水平也同樣可以利用這一反式激活機(jī)制而得到提高。

 

　　（八）病毒感染細(xì)胞的自殺機(jī)制

 

　　抗病毒基因治療的研究，大多數(shù)情況下是根據(jù)病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)，依照細(xì)胞內(nèi)免疫的原則進(jìn)行設(shè)計(jì)的。這些方案的設(shè)計(jì)在很大的程度上依賴于包括蛋白質(zhì)和RNA在內(nèi)的感染因素的持續(xù)高水平的表達(dá)，這也是為什么細(xì)胞內(nèi)免疫難以取得徹底治療效果的一個(gè)重要原因。因此，可以設(shè)計(jì)清除病毒感染細(xì)胞的基因治療方案，而不是單純干擾病毒的復(fù)制和表達(dá)過(guò)程。其中，自殺基因的導(dǎo)入及病毒感染細(xì)胞的清除的基因治療的策略在這一領(lǐng)域中占有重要地位。

 

　　引起細(xì)胞自殺的所謂"自殺基因（suicide gene）"種類很多，如某些病毒的基因，已知白喉毒素（DTA）在極低水平的情況下即可引起細(xì)胞發(fā)生死亡，促進(jìn)藥物代謝和轉(zhuǎn)換的基因，如水痘-帶狀皰疹病毒（VSV）胸腺嘧啶核苷激酶（TK），可使無(wú)毒的丙氧鳥苷（GAN，ganciclovir）轉(zhuǎn)換為毒性極強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，殺死細(xì)胞，HSV的TK基因也有類似的效果。另外還包括引起細(xì)胞程序化死亡（PCD,programmmed cell death）的基因等。

 

　　上述自殺基因的導(dǎo)入，可以有效地殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞是無(wú)疑的，但怎們保證細(xì)胞自殺的范圍僅限于病毒感染的細(xì)胞，而對(duì)于正常細(xì)胞無(wú)明顯副作用是設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵。這種基因治療的方案也同樣可以利用病毒感染細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。法國(guó)的Klatzman等根據(jù)HIV及其感染細(xì)胞的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了HIV感染細(xì)胞的自殺機(jī)制，以清除病毒感染的細(xì)胞，取得取較為滿意的治療效果。首先，將DTA基因重組到缺失突變型HIV LTR啟動(dòng)子的下游，`如果細(xì)胞加沒(méi)有HIV的感染并提供反式激活蛋白，這種DTA就不會(huì)表達(dá)；但如果細(xì)胞感染了HIV，HIV的復(fù)制和表達(dá)過(guò)程同時(shí)為DTA的表達(dá)提供了的反式激活劑，經(jīng)刺激表達(dá)以后，可以引起HIV感染細(xì)胞的死亡。沒(méi)有感染HIV的細(xì)胞存在反式激活蛋白，DTA不表達(dá)，可以完好存活下來(lái)。利用這種機(jī)制就能選擇性地清除病毒感染的細(xì)胞。因此自殺機(jī)制也是抗毒基因的治療的一個(gè)重要組成部分。

 

　　（九）反義核苷酸

 

　　反義核苷酸包括反義寡聚脫氧核糖核苷酸（ODN，oigodeoxynucleotide）和反義RNA兩種。反義RNA是在研究原核細(xì)胞基因調(diào)控中發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)性調(diào)節(jié)因素。但后來(lái)證明，真核細(xì)胞的基因調(diào)控中也有反義RNA的參與。認(rèn)為反義RNA分子在基因表達(dá)的調(diào)控中具有普遍 的意義。反義RNA與其序列互補(bǔ)的靶RNA以堿基酸對(duì)方式結(jié)合。阻斷基細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，剪切加工，與核糖體的結(jié)合。而且激活內(nèi)源性的核核酶（如RNaseH等）將其分解。以抑制或阻斷某一基因的表達(dá)和功能。這一基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，很快也應(yīng)用了抗病毒基因治療的研究中。

 

　　Chatterjee 等應(yīng)用腺相關(guān)病毒（AAV）載體構(gòu)建了HIV RNA的反義RNA的表達(dá)載體，將這種重組表達(dá)載體導(dǎo)入到T淋巴細(xì)胞中，表達(dá)的反義RNA可與HIV LTR TARA 的一段63bp的序列補(bǔ)。這種反義RNA的表達(dá)，對(duì)HIV-1的抑制率達(dá)70-90%。反義RNA不僅在控制HIV-1感染中具有重要作用，而且在控制HBV，HSV人乳頭瘤病毒（HPV），勞氏肉瘤毒（RSV）等的感染中都有重要應(yīng)用。

 

　　（十）核酶

 

　　核酸（ribozyme）是一種具有酶的催化作用，能夠在GUC等特定的核苷酸序列的下游切割RNA分子的一類小RNA分子。核酸RNA分子的發(fā)現(xiàn)，打破了蛋白質(zhì)在酶學(xué)領(lǐng)域中一統(tǒng)天下的局面，將酶的概念從蛋白質(zhì)擴(kuò)展到核酸領(lǐng)域。核酸RNA分子與底物RNA分子堿基酸對(duì)的方式進(jìn)行結(jié)合，保證了核酶作用的高度特異性。同時(shí)，核核酸與底物結(jié)合形成的酶學(xué)活性中心，可對(duì)底物進(jìn)行切割，破壞其結(jié)構(gòu)。這樣，經(jīng)切割的RNA鏈再也不能作為翻譯蛋白質(zhì)的模板，也不能作為逆轉(zhuǎn)錄的模板進(jìn)行核酸的復(fù)制。核酶裂解物RNA高度特異性，高效裂解RNA底物的性質(zhì)，作為抗病毒基因治療的新型分子，受到了廣泛的重視。認(rèn)為核酸技術(shù)是抗病毒基因治療方案設(shè)計(jì)中重要探索方向。 核酸首先是在植物類病毒，衛(wèi)星病毒及某些原蟲，如四膜蟲（tetrahynena）等的研究中發(fā)現(xiàn)。總結(jié)這些核酸RNA分子的基本結(jié)構(gòu)，大致有錘頭狀（hannerhead motif）。發(fā)夾狀（hairpin motif）以及斧頭狀（axed motif）等結(jié)構(gòu)類型。根據(jù)這些核酸基本結(jié)構(gòu)類型，設(shè)計(jì)相對(duì)保守的活性中心結(jié)構(gòu)，根據(jù)底物RNA鏈中裂解位點(diǎn)及其附件的核苷酸序列結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)核酶的側(cè)翼序列（flanking sequence）。從理論上來(lái)講，只要了解底物RNA 的系列及結(jié)構(gòu)性質(zhì)，就能設(shè)計(jì)出針對(duì)任何RNA分子的特異性核酶。核酶RNA分子中的側(cè)翼序列長(zhǎng)謔只要保證在17nt以上，設(shè)計(jì)的核酶與底物RNA 分子結(jié)合的特異性，就會(huì)對(duì)人體細(xì)胞中正常的RNA發(fā)生列解反應(yīng)。因?yàn)榧词褂幸粋�(gè)核苷酸不能正確配對(duì)，活性中心就不能形成，列解反應(yīng)就不會(huì)發(fā)生。

 

　　核酸的本質(zhì)是RNA，從自然界中提取純化針對(duì)特異基歷片段的核酶RNA 分子是根本行不通的。人工RNA的合成是一條途徑，但價(jià)格昂貴。沒(méi)有實(shí)用前途。基因RNA制藥又沒(méi)有突破性的進(jìn)展。因此，核酶的實(shí)際應(yīng)用還需走基因治療的途徑。即體外設(shè)計(jì)核酶的編碼基因，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。這種基因治療的策略已經(jīng)過(guò)較為周密的細(xì)胞及動(dòng)物水平的系統(tǒng)研究，美國(guó)已于1994年夏天開始抗HIV基因治療的I期臨床實(shí)驗(yàn)。

 

　　1990年，Sarver等首次構(gòu)建了HIV特異性核酶的重組表達(dá)載體，并在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外成功地對(duì)HIV RNA進(jìn)行了切割，以及抗HIV基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。抗HBV的核酶基因治療也順利進(jìn)行。1992年，Chen等設(shè)計(jì)了9靶位的抗HIV核酶及Weizsacker等設(shè)計(jì)了3靶位抗HBV的核酶，使核酶的抗病毒技術(shù)日致成熟，成為抗病毒基因治療中又一重要的研究方向。想信核酶抗病毒基因治療途徑在未來(lái)的抗病毒基因治療研究中發(fā)揮更大的作用。

 

　　三、 病毒性肝炎的基因疫苗

 

　　將重組表達(dá)載體直接導(dǎo)入在體的器官和組織中，并獲得目的基因的表達(dá)，這在10余年之前就已實(shí)現(xiàn)，并作為某些基因治療方案中外源基因?qū)�入體內(nèi)的一種方式而受到了廣泛的重視。但利用這一技術(shù)將一種誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原蛋白的重組表達(dá)載體導(dǎo)入體內(nèi)，作為預(yù)防和治療傳染病的一種技術(shù)，不過(guò)是近幾年的事情。Ulmer等首先以流感病毒（influenza） 核殼蛋白（NP）的重組表達(dá)載體DNA接種健康小鼠，取得有效的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，并可以保護(hù)免疫動(dòng)物不受多種流感病毒的感染攻擊，從而開創(chuàng)了基因疫苗防治傳染病的新時(shí)代。

 

　　（一） 基因疫苗的發(fā)展

 

　　流感病毒基因疫苗的研究開創(chuàng)了基因疫苗預(yù)防與治療傳染性疾病的新時(shí)代。流感病毒基因疫苗首先采用了高度保守的流感病毒核殼蛋白編碼基因，獲得了不同株流感病毒的交叉免疫保護(hù)作用。特別是后者又具有更為重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)橹T如人免疫缺陷病毒（HIV），丙型肝炎病毒（HCV）等病毒基因組存在著不同的基因型，而且在機(jī)體免疫選擇的壓力下還在繼續(xù)發(fā)生突變，如HCV的準(zhǔn)種性就是一個(gè)典型的例子。對(duì)于流感病毒這種抗原多變性病毒基因疫苗研制的成功，其意義是廣泛而深刻的。

 

　　自1993年以流感病毒基因組構(gòu)建基因疫苗表達(dá)載體而獲得成功以后，在短短在2年中，基因疫苗技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，不但從流感病毒擴(kuò)展到HIV，HCV，乙型肝炎病毒（HBV）等病毒感染領(lǐng)域，還擴(kuò)展到細(xì)菌，寄生蟲，支原體等其它的傳染病領(lǐng)域。不僅如此，抗腫瘤，自身免疫性疾病的基因疫苗研究也進(jìn)展迅速。到1995年，抗腫瘤，抗HIV的基因疫苗在完成實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物模型研究并取得良好的結(jié)果的基礎(chǔ)上，已開始I期臨床試驗(yàn)。這在一種生物學(xué)治療方法，從概念與技術(shù)路線的提出，到臨床I期試驗(yàn)，是時(shí)間最短的一次。現(xiàn)代生物學(xué)高技術(shù)發(fā)展速度之快，由此可見一斑。

 

　　（二） 傳染病基因疫苗研究概況

 

　　關(guān)于傳染病基因疫苗的研究，一方面尋找保護(hù)易感人群的有效免疫方法，同時(shí)基因疫苗又為難治性傳染病的治療提供了新的機(jī)遇。

 

　　1、 病毒感染性疾病的基因疫苗

 

　　HBV的基因疫苗研究，采用了乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒核心蛋白（HBcAg）的基因分別構(gòu)建表達(dá)載體，或構(gòu)建兩種蛋白的融合基因，都能誘導(dǎo)免疫接種小鼠出現(xiàn)特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。HCV基因疫苗的研究主要集中在核殼蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）等編碼基因區(qū)，但也有少數(shù)研究采用了包膜區(qū)E1和E2區(qū)進(jìn)行基因免疫。HIV基因疫苗則主要集中在HIV包膜糖蛋白的編碼基因區(qū)，如gp160,gp120和gp41等的編碼基因區(qū)。目前將HIV各種蛋白成份進(jìn)行組裝，成為不含核酸成份的非感染性病毒蛋白顆粒，其免疫效果較單一的病毒蛋白成份要好得多。流感病毒基因疫苗除了采用抗原性多變的血凝素抗原（HA）編碼基因以外，還昆采用了高度保守的核衣殼蛋白（NP）的編碼基因，從而避開了流感病毒抗原漂變，不易制備具有普遍意義的預(yù)防疫苗的難點(diǎn)。另外，對(duì)于狂犬病毒（Rabies virus），單純皰疹病毒（HSV），人乳頭瘤病毒（HPV），淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢病毒（LMCV）的基因疫苗研究也取得了顯著的進(jìn)展。

 

　　2、 細(xì)菌感染性傳染病的基因疫苗

 

　　針對(duì)細(xì)胞感染而設(shè)計(jì)的基因疫苗也取得了顯著的進(jìn)展。結(jié)核桿菌感染目前在全球范圍內(nèi)又呈上升的趨勢(shì)。卡介苗的接種其免疫效果也值得進(jìn)一步研究，而且在很多國(guó)家沒(méi)有普遍進(jìn)行卡介苗的預(yù)防接種。根據(jù)結(jié)核桿菌免疫的一些特點(diǎn),設(shè)計(jì)了結(jié)核桿菌65kDa的熱休克蛋白（HSP65）的基因疫苗，可以誘導(dǎo)特異性的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)于隨后接種的結(jié)核桿菌的感染具有顯著的抵抗能力。以HSP65基因疫苗免疫所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用與接種活的卡介苗的免疫保護(hù)作用效果相似，但以HSP65蛋白作為亞單位疫苗進(jìn)行免疫接種則無(wú)此免疫保護(hù)效果。同時(shí)，以來(lái)源于結(jié)核桿菌36kDa的富含脯氨酸的蛋白的編碼基因進(jìn)行基因免疫，也能取得對(duì)結(jié)核桿菌感染的免疫保護(hù)作用。Huygen等應(yīng)用結(jié)核桿菌抗原85（Ag85）的編碼基因進(jìn)行基因免疫，也獲得了良好的免疫效果。

 

　　（三） 病毒性肝炎基因疫苗研究的展望

 

　　傳染病基因疫苗的研究，首先要從傳染病病原體的分子生物學(xué)研究做起。到目前為止，為數(shù)不少的傳染病的病原體的基因結(jié)構(gòu)及其編碼產(chǎn)物的性質(zhì)還沒(méi)有弄清楚，這是妨礙傳染病基因疫苗研究的一個(gè)瓶頸。只有解決好這個(gè)前提，才能選擇好基因疫苗的目的的基因。

 

　　傳染病基因疫苗的研究，還要研究各種病原體抗原成份免疫應(yīng)答的機(jī)制。許多研究已證明，并不是所有病原體的基因片段構(gòu)建成的基因疫苗都能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答，而且每一種基因疫苗的免疫應(yīng)答能力也是千差萬(wàn)別的。基因疫苗能夠誘導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主的保護(hù)性免疫免疫應(yīng)答是其區(qū)別于滅活疫苗與亞單位疫苗的重要標(biāo)志，也是普遍認(rèn)為基因疫苗為難治性傳染病治療方法最有前景的基本依據(jù)。但基因疫苗及其免疫應(yīng)答的機(jī)制的研究還不系統(tǒng)。

 

　　傳染病基因疫苗的研究，其生命力還在于新型基因疫苗的研制。如慢性乙肝病人血清中有高滴度的乙肝病毒表面抗原（HBsAg），但機(jī)體多已發(fā)展為對(duì)HBsAg的免疫耐受。盡管研究表明基因免疫因其抗原的加工與提呈的路徑不同，從而產(chǎn)生與蛋白抗原不同的免疫效果，但以HBsAg的基因疫苗進(jìn)行免疫接種時(shí)能否有效治療慢性乙型肝炎還不一定。因?yàn)槟壳暗难芯看蟛糠旨�中在正常�?dòng)物的免疫應(yīng)答上，但慢性乙肝病菌對(duì)HBsAg的應(yīng)答已經(jīng)發(fā)生了根本的變化，不能僅僅根據(jù)正常動(dòng)物的免疫應(yīng)答情況，推測(cè)慢性病毒感染個(gè)體的免疫應(yīng)答。抗獨(dú)特型基因疫苗恐怕是解決這一問(wèn)題的有效途徑。設(shè)計(jì)單一T細(xì)胞表位的基因疫苗也是較好的選擇之一。在某些情況下設(shè)計(jì)針對(duì)不合適的原位點(diǎn)的免疫應(yīng)答，反而促進(jìn)病原體免疫逃逸株的形成或加重感染的程度。因此，采用針對(duì)單一T細(xì)胞位點(diǎn)的基因疫苗免疫策略更為有利。基因疫苗的研究還不得不重視抗原加工和抗原提呈方面輔助因子的功能。在某些情況下，可能是因?yàn)槿狈��?qiáng)免疫原的刺激，但也可能是因?yàn)榭乖�加工和提呈的輔助信號(hào)出現(xiàn)障礙，最終不能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。此時(shí)僅考慮病原體的抗原性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，免疫應(yīng)答的輔助刺激信號(hào)也具有同等重要的地位。隨著這些技術(shù)環(huán)節(jié)的進(jìn)一步解決，相信基因疫苗將是率先用于臨床傳染病治療的一種基因治療手段。