黃岑甙是中藥黃岑中的一種黃酮類化合物，臨床上許多清熱解毒和抗菌消炎的中成藥中都含有黃岑甙。近年來的研究表明，黃岑中的黃酮成分還有抗癌和誘導腫瘤細胞凋謝的作用。Powell等的研究表明，黃岑水提物對卵巢癌和乳腺癌細胞具有抑制再生作用，并抑制細胞高表達Bcl-2,。我們在Wistar大鼠腦深部復制膠質瘤模型，并給予黃岑甙治療，分析治療后大鼠腦膠質瘤的病理學和影像學檢驗結果，以及大鼠平均生存的時間和體重變化情況，評價黃岑甙治療在體腫瘤的效果，探討其可能的作用機制。

　　材料與方法
　　一、材料
　　1. 細胞系：C6細胞系由哈爾濱醫科大學第一臨床醫院神經神經外科研究所提供，37℃、5% CO?培養箱中常規培養。
　　2. 實驗動物：雄性Wistar大鼠32只，鼠齡6~8周，體重250`280g，由哈爾濱醫科大學第一臨床醫院動物室提供。
　　3. 藥物：黃岑甙（純度為98%，分子量為446.35），由哈爾濱醫科大學第二醫學院藥學部提供。
　　4. 試劑與儀器：小牛血清由哈爾濱獸醫研究所提供，RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，血卟啉單甲醚（HMME）由第二軍醫大學提供，p53單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體、SABC制劑盒、DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司，釓噴酸葡胺（Gd-DTPA）購自德國先上海靈公司，戊巴比妥鈉為上海化學制劑廠產品。Visart1.5T MRI機（日本東藝公司），江灣型立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司），Relchert-Jung超薄切片機（德國徠卡公司），JEM-1220透射電子顯微鏡（日本電子公司）。

　　二、方法
　　1. 細胞培養：將C6膠質癌細胞以含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養液，于37℃、5% CO?培養箱中常規培養。0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代時間為2~3d。選擇對數生長長期細胞進行分組實驗。
　　2. 建立大鼠腦膠質癌模型：參考文獻的方法復制Wistar大鼠腦深部膠質癌模型。將健康Wistar大鼠，以1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀頭架上，術區消毒，切開頭皮，暴露顱骨標志。接種靶點為大鹵中點前1.0mm，矢狀縫右旁開3.0~3.5mm，硬膜下5mm。行顱骨鉆孔，立體定向引導下微量注射接種C6細胞（吸入15µl C6細胞懸液，含1×106個C6細胞，細胞存活率>95%）。注射時間>10mm，留針5mm后緩慢退出，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮，自由進食水。選擇接種后7d的大鼠作為本實驗腦膠質癌模型。
實驗分組;32只Wistar大鼠接種C6細胞后7d，隨機分為實驗組和對照組。實驗組24只，分為小劑量組（50mg.kg-1.d-1）8只，中劑量組劑量組（100mg. kg-1.d-1）8只，大劑量組（200mg. kg-1.d-1）8只，給予黃岑甙灌胃；對照組8只，給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，30mg. kg-1.d-1。
　　3. 一般狀態和生存期觀察：每天觀察大鼠意識、接觸反應、運動狀態、顱神經癥狀、視覺反應、偏癱、蒼老和癲癇等一般情況。每天測量大鼠體重，記錄大鼠的死亡日期。死亡以自然死亡或瀕死前處死為標準，計算大鼠的生存期。
　　4. MRI動態觀察：大鼠接種C6細胞后7天、第14天和第21天，腹腔注射Gd-DTPA后行增強掃描。
　　5. 病理學檢查：麻醉開顱后取腫瘤組織，4%甲醛固定，常規光鏡、電鏡標本制作，觀察。
　　6. 免疫組織化學：采用SABC法，觀察大鼠腦膠質細胞癌p53和Bcl-2蛋白的表達。結果判斷Bcl-2表達陽性為細胞質中出現棕黃色顆粒，細胞核呈明顯的棕色反應為p53表達陽性。染色強度分為4級：陽性細胞百分數≤5%為陰性（—）；6%~25%為陽性（+）；26%~50%為中度陽性（++）；51%~100%為強陽性（+++）。

　　三統計學習方法
　　采用SAS統計軟件進行分析。所有數據均以x±s表示，單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，多組資料之間的采用單因素方差分析。檢驗水準ɑ=0.05。

　　結 果
　　大鼠的一般狀態和生存情況：大鼠初期無明顯癥狀，從第3天開始，運動量逐漸減少，攻擊性下降。對照組和小、中劑量組分別從第9、11、15天開始飲水進食減少，出現皮毛不整潔，精神萎靡:從第12、14、18天開始，逐漸有大鼠出現左側或雙側肢體無力，進行性加重。后期出現面容蒼老，眶周出血，刺激反應減弱甚至呈木僵狀，偶有癲癇發作。瀕死前表現為極度惡液質，呼吸衰弱。而大劑量組上述情況出現較晚。

　　接種后，大鼠早期體重大多無明顯下降，甚至呈現輕微的上升趨勢，一般在第7天（對照組）、第8天（小劑量組）和第10天（中劑量組），大鼠的平均體重逐漸減輕，并隨著時間推移出現明顯下降，在瀕死前最低。在同時間大劑量組大鼠體重明顯下降緩慢或不下降。

　　１．小、中、大劑量組和對照組大鼠的生存時間分別為（24.14±4.01）d、（25.37±3.96）d、（42.83±4.77）d、和（23.49±3.84）d。小、中劑量組與對照組大鼠的生存時間比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）；大劑量組與對照組大鼠的生存時間比較，差異有統計學意義（P<0.01）。

　　2．大鼠腫瘤的大體狀態：各組大鼠處死（瀕死）前腫瘤的體積。小、中劑量組與對照組大鼠的腫瘤體積比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）;大劑量組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。

　　大鼠腫瘤的MRI表現顯示，接種C6細胞后，所有大鼠右側尾殼核均有強化后的短T1、長T2占位信號影，提示有腫瘤生長。在腫瘤接種后7d，即分組治療前，各組大鼠腫瘤平均直徑為3.00mm。在黃芩甙治療后各時間點，各治療組大鼠腦內腫瘤直徑增長較對組減慢，大劑量組大鼠處死（瀕死）前腫瘤最大徑和腫瘤體積均明顯低于對照組（均P<0.01）。對照組腫瘤生長迅速，腫瘤中心存在存在不強化的中心壞死區、強化環和周圍水腫區；中、大劑量治療組腫瘤未見明顯壞死區，腫瘤體積增長減慢，大劑量組可見腫瘤體積縮小。

　　大鼠腫瘤組織的病理學特點：各組大鼠大體病理均可見右側尾狀核腫瘤。新鮮標本可見，腫瘤組織較周圍正常腦組織顏色深、無包膜、邊界不清、呈灰黃色、魚肉狀，有較多的新生血管，腫瘤向周圍腦組織浸潤性生長，周圍腦組織水腫，中線結構向對側移位。大多數腫瘤切面可見出血或壞死。

　　腫瘤組織HE染色顯示，對照組可見生長活躍的瘤細胞密集成群，部分腫瘤細胞圍繞增生小血管或壞死灶云集在一起，呈花環狀，在瘤組織邊緣可見大量增生的毛細血管，向腦組織浸潤生長，但無包膜形成，癌組織中可見灶性出血、壞死，癌細胞異形性明顯，體積較大，呈圓形或多角形，胞質紅染，細胞核大深染，核分裂象多見，亦可見壞死細胞，細胞膜不完整，細胞核很淡甚或消失，周邊可見出血灶；大劑量組腫瘤組織可見癌細胞數量明顯減少，腫瘤細胞壞死，細胞質溶解，僅剩核碎片堆積在一起。

　　腫瘤組織透射電鏡觀察顯示，接種21天，對照組可見腫瘤細胞生長活躍，細胞形態圓形或不規則，細胞表面可見微絨毛結構，細胞核圓形或不規則形，核內易染質較多。大劑量組腫瘤接種第21天，可見細胞表面微絨毛明顯減少，伸出偽足樣物質，細胞膜結構清晰，細胞核膜下染色質輕度邊集，細胞核內染色質形成明顯的斑塊，細胞核畸變明顯，粗面內質網擴張脫顆粒，線粒體減少，部分線粒體嵴膜形成髓樣變，細胞膜完全破裂，無細胞器結構。

　　免疫組化染色結構顯示，在C6膠質癌細胞中，p53蛋白定位于細胞核，呈棕色著色，陽性細胞密度高，數量多。Bcl-2在細胞質中表達，呈棕黃色顆粒，陽性細胞密度高，數量多。對照組p53蛋白強陽性細胞百分百為（84.47±3.74）%，中度陽性細胞百分比為（47.28±2.38）%，與陰性細胞百分比 [（12.91±1.07）%]比較，差異均有統計學意義（均P<0.01）；大劑量組p53蛋白強陽性細胞百分比與對照組比較，差異有統計學意義（均P<0.01）。對照組Bcl-2蛋白強陽性細胞百分百為（86.51±4.17）%，中度陽性細胞百分比為（48.19±2.11）%，與陰性組[(10.36±1.43)%]比較，差異均有統計學意義（均p<0.01）.

　　討論
　　近年來，中藥在腫瘤治療方面取得了一定的成績，特別是在增強免疫、整體調節方面。通過研究中藥抗腫瘤的組方特點，提示我們開發抗腫瘤中藥新藥，可堅持攻補雙施、聯合用藥的原則，有研究表明，黃岑甙具有很好的抗腫瘤作用，其機制可能與促進腫瘤細胞凋亡有關。

　　細胞凋亡又稱程序性死亡是在內外因素誘導下出現的一種自發的死亡過程，是一個主動、高度有序、基因控制以及一系列酶參與的過程。有研究表明，細胞凋亡過程的異常和紊亂與腫瘤的發生密切相關，因此，誘導腫瘤細胞凋亡成為當今腫瘤治療的熱點之一。

　　p53、Bcl-2、c-myc和fas等基因是細胞凋亡分子機制的調控位點，而p53和Bcl-2在凋亡過程作用顯著。p53是重要的抑癌基因，分為野生型和突變型。突變型P53蛋白在細胞核內表達，半衰期長，通過免疫組化可以檢測。而野生型p53，因其半衰期短，通過免疫組化很艱難檢測，但可誘導DNA損傷，使不能修復的細胞發生凋亡，防止具有癌變傾向的基因突變細胞產生，從而發揮其抑癌作用。Bcl-2是凋亡的抑制基因，其過度表達能增高細胞對大多數DNA損傷因子的抵抗性，抑制大多數化療藥物所引起的靶細胞凋亡，但其本身并不能抑制這些因素對細胞的損傷，也不能促進DNA修復。p53是DNA損傷的一個分子傳感器，已經證實Bcl-2能抑制p53介導凋亡，但不能抑制p53向核內轉位或者p53介導的生長停滯，可能Bcl-2的作用是在DNA損傷后，阻止激活凋亡機制的信號到達其靶分子。

　　既往的研究結果顯示，黃岑甙對培養腫瘤細胞有明顯的增殖抑制作用，它主要作用于細胞核，破壞核結構。黃岑甙抑制野生型p53表達，干擾DNA合成，使細胞阻滯在C0/C1期，并激發細胞凋亡途徑，使細胞死亡。Ueda等研究表明，黃岑甙通過線粒體途徑來誘導caspase-3活化和細胞凋亡。當細胞內DNA遭受急性損害或有致癌信號時，野生型p53可以暫時或永久阻止細胞分裂，停止其進展。在個別情況下，為了預防腫瘤的發生，野生型p53可以使變異細胞產生自殺效應。最新研究表明，這種效應是通過轉錄激活域（transactivation domain,TAD），即TAD1和TAD2相互調節發揮作用。同時，該效應還可使正常細胞免受化療或放療引起的巨大損傷性負作用。有研究表明，在低度惡性星形細胞癌中，p53突變細胞在腫瘤組織中所占比例很小，但隨著惡性度增加，p53突變的細胞數量不斷增加，表明腦膠質癌在組織學上由低度惡性到高度惡性程度的進展可能源于某些細胞的克隆增殖。在腫瘤發生的早期，發生p53突變的細胞所占比例小，不足以出現高度惡性度的表型，隨著惡性程度增加，P53突變的細胞數量不斷增加，使腫瘤惡性增殖并增加復發的機會。大量證據表明，許多抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細胞是通過誘導細胞凋亡來實現的，其效能與其誘導細胞凋亡的能力密切相關。提高腫瘤細胞凋亡率或逆轉其凋亡抗性，就有可能提高化療效果。多藥耐藥（multidrug resistance,MDR）是腫瘤藥物治療的主要障礙之一，而細胞凋亡調節基因的突變導致細胞凋亡功能的異常也是腫瘤細胞產生耐受性的機制之一。Bcl-2的突變可抑制細胞凋亡，導致細胞產生耐藥性；p53突變可可大大降低腫瘤細胞對輻射以及抗癌藥物易感性，提高細胞損傷刺激細胞凋亡的閾值，因此，臨床耐藥與凋亡有關。

　　我們采用免疫組化染色方法檢測大鼠C6膠質癌p53和Bcl-2蛋白表達，結果顯示，C6膠質癌突變型p53和Bcl-2呈高表達，大劑量黃岑甙可抑制突變型p53高表達，但不能抑制Bcl-2高表達，與細胞檢測結果一致，提示黃岑甙可通過抑制p53高表達而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖，激活細胞凋亡通路。膠質癌本身是一種侵襲性生長的腫瘤，采用手術切除后，腦內殘留的細胞大為減少，但部分殘余細胞仍為存在，此時就需要化療殺傷殘存的惡性腫瘤細胞。黃岑甙作為黃岑提取物中的一種有效成分，對多種腫瘤有抑制增殖作用。本研究結果顯示，黃岑甙能明顯抑制C6膠質癌生長，延長動物生存時間。黃岑甙是否存在其他的作用機制抑制膠質癌，尚有待進一步研究。（來源：中華腫瘤雜志2013年1月 第35卷 第1期《黃岑甙對大鼠腦膠質癌的抑制作用》胡永珍 王殿洪 欒或 龔海東）

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