泰素帝誘導人肺腺癌細胞凋亡的實驗研究

來源：新特藥房藥訊作者：百濟動態瀏覽：發布時間：2008/2/28 9:00:00

李瑛　石廷章　趙衛紅

　　摘　要：目的　探討泰素帝誘導人肺腺癌細胞凋亡的作用機制。方法　應用形態學方法、流式細胞術(FACS)、DNA凝膠電泳、Annexin v標記等方法檢測細胞凋亡的發生，應用RT-PCR檢測凋亡相關基因 fas、bcl-2、c-myc表達的變化。結果　泰素帝對人肺腺癌細胞系 a549細胞的生長有明顯的抑制作用，使細胞分裂阻滯于G2M期，并誘導腫瘤細胞發生凋亡。凋亡細胞表現為細胞固縮，核染色質聚集或斷裂，DNA凝膠電泳顯示清晰的DNA梯形條帶，FAGS檢測在G1期之前出現 sub-G1峰，凋亡率最高為 15.69%，Annexin V標記的方法檢測凋亡時發現，壞死和凋亡共存。在泰素帝誘導 a549凋亡的過程中，凋亡相關基因 Fas轉錄水平比用藥前增強，bcl-2和c-myc無明顯變化。結論　除了壞死，凋亡也為泰素帝抑瘤的機制之一。泰素帝誘導 a549凋亡可能主要與促進 Fas基因表達有關。

　　主題詞：肺腫瘤；腺癌；泰素帝；細胞凋亡；Fas基因

　　泰素帝是 1986年由法國羅納普朗克*樂安公司首先生產的一種半合成抗癌新藥。其結構類似紫杉醇，是從歐洲紫杉針葉提取加工的，有促進細胞微管聚合、抑制微管解聚的作用，使細胞不能進行正常的有絲分裂。泰素帝的來源較紫杉醇更易獲得，對某些腫瘤的殺傷作用是紫杉醇的2倍，并且對某些過度表達P-糖蛋白的耐藥細胞株仍然有效［1］。經多年的臨床研究結果表明，其對多種癌癥有效，特別是對轉移性乳腺癌和晚期非小細胞癌［2］。在白血病和乳腺癌細胞的體外實驗研究中，已經發現泰素帝的細胞毒性與其誘發細胞凋亡的作用有關［3，4］。泰素帝作為治療非小細胞肺癌最有前景的新藥［5］，體內外實驗均顯示，對非小細胞肺癌有生長抑制和殺傷作用，但尚未見泰素帝誘導肺癌細胞凋亡的報道。我們選擇人肺腺癌株 a549來探討泰素帝誘導凋亡發生的比例及機制，為泰素帝臨床應用提供理論依據。

材料與方法

　　一、材料

　　人肺腺癌細胞系 A549購自解放軍總醫院腫瘤生物研究所。泰素帝為法國羅納普朗克*樂安公司提供。bcl2引物擴增產物為170 bp，c-myc 為170 bp, Fas 為190 bp，β-actin (內標)為 450 bp。

　　二、方法

　　1.細胞培養： A549用含 10%小牛血清 RPMI 1640 培養基，在37℃、5% cO2飽和濕度的條件下培養，實驗時取對數生長期細胞。

　　2.形態學觀察：細胞懸液離心涂片，瑞氏染液染色 5 min，光鏡下觀察。

　　3.電鏡觀察：收集 106細胞，離心后以 3%戊二醛固定24 h，1% OsO4固定2 h，常規脫水、包埋、聚合、切片、染色。

　　4.DNA 凝膠電泳：采用盧圣棟［6］的快速法提取 dNA。細胞懸液溶于 DNA提取液1中，加入 NP-40，混勻后離心棄上清；沉淀加入 dNA提取液 2及6 mol/L NaCl，混勻后離心取上清，用乙酸銨、冰乙醇沉淀 dNA；沉淀物溶于 TE緩沖液；經1.8%瓊脂糖凝膠電泳。

　　5.流式細胞儀分析：經流式細胞術(FACS)常規預處理細胞后上機測定細胞周期分布及凋亡率，以未加藥者為對照組。

　　6.Annexin V標記：使用 Boehringer Mannheim 公司試劑盒 annexin-V-flous。收集 106/ml 細胞，加入 200 μl工作液，室溫下10～15 min后上機檢測。

　　7.RT-PCR：首先提取 RNA，收集 107細胞加入 200 μl裂解液及氯仿，離心取上層水相；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(24∶24∶1)，離心吸取上清；加入醋酸鈉和異丙醇，-20℃放置20 min，離心棄上清，室溫晾干。然后進行反轉錄反應，樣品加入15 μl RT液，1 μl 酶混合離心數秒，42℃水浴 30 min。最后進行 pCR反應，加入 PCR液 20 μl，1 μl Taq酶，1滴石蠟油，離心數秒，上機進行 pCR循環；變性 94℃ 45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 45 s，共35個循環。經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察照相。

　　8.統計分析：均采用 6.04版 SAS軟件，進行統計分析。

結果

　　1.細胞形態學變化：0.1μmol/L泰素帝作用于A549 72 h時，光鏡下觀察有10%～20%細胞出現固縮，細胞核染色質聚集，斷裂成數個圓形顆粒，胞膜仍完整。電鏡下可見細胞體積變小，胞漿凝縮，內質網疏松與胞膜融合成一個個空泡，核內染色質凝聚成新月狀附著于核膜邊(圖1)。以上形態改變表明，A549在泰素帝誘導下出現了細胞凋亡。另有部分腫脹細胞，胞膜已破碎，細胞器崩潰，染色質疏松為壞死細胞。

　　當泰素帝劑量加大時，則花團樣多核細胞更多，腫脹破裂的壞死細胞比例更大，而核固縮的凋亡細胞并未增多。

　　2.DNA 凝膠電泳分析：0.1 μmol/L泰素帝作用于 A549 72 h始出現梯形條帶，在(0.01～10)μmol/L 范圍內作用 72 h均出現凋亡特有的梯形條帶，但當劑量加大至10μmol/L時，其背景夾雜有壞死的膜狀改變(圖2)。

　　3.流式細胞術(FCM)：經 FCM進行周期檢測，泰素帝 0.1 μmol/L作用12 h已有明顯的G2M阻滯；當 1 μmol/L作用 48 h時，G2M期細胞高達80.01%。第3天以后，由于部分阻滯的細胞發生死亡，使G2M、G1、S期細胞均相應減少，Sub-G1期細胞增多。亞二倍體峰 sub-G1峰的面積代表凋亡細胞的比例(apo%)。泰素帝 0.1 μmol/L作用 A549 72 h的 apo%最高為15.69%，其他濃度時間的 apo%均低于此值。

C：A549對照組；1～4：0.01，0.1，1.0，10μmol/L泰素帝作用72 h組；Mr：PBR 322BstN1圖2　DNA凝膠電泳結果

　　4.Annexin-V-flous標記：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylscrine, pS)正常時分布于細胞膜內，細胞發生凋亡早期便從膜內翻轉至膜外。Annexin v在Ca2+存在時可以和PS特異結合，故 Annexin V試劑盒可作為檢測凋亡的早期手段，且較敏感［7］。結合碘化丙啶(PI)染色，可將細胞分為4種屬性：Ⅰ象限：PI高染，異硫氰酸熒光素(FITC)低染，為壞死細胞；Ⅱ象限：PI、FITC均高染為凋亡后壞死細胞及部分壞死細胞；Ⅲ象限：PI、FITC均低染為正常細胞；Ⅳ象限：PI低染，FITC高染，為凋亡細胞。因Ⅱ象限由凋亡后壞死細胞和部分壞死細胞兩部分組成，無法區分，故除了對Ⅰ和Ⅳ象限分別進行凋亡和壞死的粗略統計外，還應考慮Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ象限的數值(表1)。

　　泰素帝0.1 μmol/L作用于A549 24h，壞死比對照組增加了3.3倍，而凋亡比例不高。第2天壞死比例下降，凋亡比例增加，是第1天的2.4倍，象限Ⅱ(凋亡后壞死和部分壞死)為對照組的 3.8倍。結合象限Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ的數值變化，提示凋亡后壞死占有相當比重。

　　5.凋亡的相關基因：泰素帝 0.1 μmol/L作用于A549 24 h后，Fas基因轉錄較用藥前增強，而c-myc和bcl-2基因的轉錄無明顯變化(圖3)。

表1　泰素帝1.0 μmol/L對A549的annexin V檢測

組別	時間　　(d)	細胞百分比(%)
組別	時間　　(d)	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅱ+Ⅳ	Ⅰ+Ⅱ
對照組	1	2.8	8.2	80.6	8.5	16.7	11.0
泰素帝	1	12.1	17.8	66.8	3.4	21.2	29.9
泰素帝	2	11.6	31.4	48.8	8.2	39.6	43.0

討論

　　1.凋亡的檢測：本實驗采用多方法檢測，發現0.1μmol/L泰素帝對人肺腺癌細胞系A549有誘導凋亡的作用，其作用72 h的apo%最高，此濃度為周期阻滯峰值濃度(1 μmol/L)的1/10。另外，凋亡的發生遲于周期阻滯，開始于48 h(即周期阻滯達峰值時)，72 h達峰值后又逐漸下降。即在腫瘤細胞陸續進入 g2M期阻滯后，凋亡的比例也開始增加，提示凋亡的發生可能與周期阻滯有關。體內實驗也有類似發現，Ronald等［8］在移植了 mca-4腺瘤的小鼠中觀察泰素帝的作用時也發現，瘤細胞在周期阻滯之后發生了凋亡和壞死，但是在鱗癌 sCC-VII，盡管周期阻滯非常明顯卻沒看到凋亡。有關二者的確切關系尚須深入研究。

　　2.泰素帝誘導凋亡在其抗腫瘤機制所處的地位：泰素帝對周期的阻滯作用已得到公認。本實驗除觀察到明顯的周期阻滯現象外，還發現在 g2M期阻滯后，大部分細胞死亡，死亡方式除了壞死外，還有凋亡，究竟凋亡在泰素帝對A549細胞系的作用中處于什么地位呢?FCM檢測其凋亡率最高為15.69%，在實體瘤誘導的凋亡中屬中低水平。另外Annexin-V實驗看到，壞死從始至終存在，且比例較高；而凋亡則早期比例較低，晚期凋亡細胞和凋亡后壞死細胞才逐漸增多。壞死似乎更占有優勢。

　　體內實驗也有類似發現。Ronald等［8］曾報道在移植了各種腫瘤的小鼠實驗中，泰素帝可引起明顯的周期阻滯以及相當低的凋亡反應(相對紫杉醇來說)，但是泰素帝的療效與二者均不相關，細胞的溶解壞死被認為是泰素帝殺傷腫瘤的主要方式。

　　3.凋亡相關基因：Fas為TNF受體超家族成員，主要表達于活化的 t細胞表面，并可表達于多種腫瘤細胞表面，包括造血系統腫瘤和非造血系統腫瘤。其在腫瘤的凋亡反應中起重要作用，在泰素帝誘導A549凋亡的過程中其轉錄增加。

　　原癌基因bcl-2是迄今為止功能最明確的細胞凋亡拮抗基因。近年研究發現，泰素帝及紫杉醇等作用于微管系統的藥物，由于破壞了微管的完整性，導致 bcl-2磷酸化，從而促使細胞凋亡［9］。本實驗中 A549細胞在使用泰素帝后 bcl-2表達并無明顯減少，應進一步檢測bcl-2家族其他成員和bcl-2的蛋白產物含量有無變化，以判斷泰素帝致凋亡是否與bcl-2家族有關。

M：Mark；1：A549對照組；2：泰素帝處理組，每列上側條帶均為β-actin內標圖3　0.1 μmol/L泰素帝對A549作用24 h的Fas、bcl-2、c-myc基因檢測

　　c-myc是癌基因中核心蛋白 myc的家族成員，是細胞生長和細胞周期演進的正調控基因。近年研究發現，它也參與凋亡過程，具有雙重性。泰素帝誘導A549的凋亡進程中，c-myc轉錄水平并無明顯變化。

　　通過泰素帝在人肺腺癌A549細胞系的抗腫瘤機制的實驗研究，可以看出泰素帝使腫瘤細胞分裂阻滯于G2M期，周期阻滯之后，腫瘤細胞以壞死和凋亡兩種方式死亡。其中Fas基因參與了泰素帝誘導A549凋亡的過程，這些都為該藥在非小細胞肺癌的治療應用提供了一定的理論依據。關于凋亡在泰素帝抑瘤機制中的地位，仍需繼續廣泛和深入的觀察研究。

圖1 經電鏡觀察的A549細胞用藥前后的形態改變。1a:A549未經泰素帝處理；1b：泰素帝0.1μmol/L作用24h，細胞核染色質連聚，為凋亡早期改變。

　　作者單位：李瑛（100853　北京，解放軍總醫院腫瘤科)

　　石廷章（100853　北京，解放軍總醫院腫瘤科)

　　趙衛紅（軍事醫學科學院二所）

參考文獻

　　1．Ringel I, Horwitz sB. Studies with RP 56976 (taxotere): a semisynthetic analog of taxol. J Natl cancer Inst, 1991,83:288-291.

　　2．Bissery MC. Preclinical pharmacology of docetaxel. Eur J Cancer,1995,31A:sl-s6.

　　3．Rita C, Pui CH, Frederick GB, et al. In vitro cytotoxicity of docetaxel in childhood acute leukemias. J Clin Oncol, 1998,16:907-913.

　　4．Ferlini C, Scambia G, Distefano M, et al. Synergistic antiproliferative activity of tamoxifen and docetaxel on three oestrogen receptor-negative cancer cell lines is mediated by the induction of apoptosis. Br J Cancer,1997,75:884-891.

　　5．Miller VA. Docetaxel in the management of advanced non-small cell lung cancer. Semin Oncol, 1998,25(Suppl 8):15-19.

　　6．盧圣棟.現代分子生物學實驗技術.第1版.北京：高等教育出版社.1993：103.

　　7．Istvan V, Clemens H, Helga S, et al. A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidyl serine expression on early apoptotic cell useing fluorescein labelled Annexin V. J Immunolgical Methods, 1995,184:39-51.

　　8．Ronald S, Kathryn A. Lack of correlation between mitotic arrest or apoptosis and antitumor effect of docetaxel. Cancer Chemother Pharmacol,1999,43:165-172.

　　9．Elizabeth Y, Stanley JK. Molecular thanatopsis: a discourse on the bcl-2 family and cell death. Blood, 1996,88:386-401.

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