腫瘤壞死因子 （TNF- ）是腫瘤壞死因子超家族的重要成員，可通過死亡受體途徑促使靶細胞凋亡，近年研究證實，扁平苔蘚的發生與細胞凋亡密切相關，我們通過檢測死亡受體途徑中TNF- 和下游關鍵分子半胱氨酸冬氨酸蛋白酶8（Caspase-8）和Caspase-3在扁平苔蘚皮損中的表達。探討其在扁平苔蘚皮損發病中的作用。 

    材料與方法 
    一、 對象 
    收集我院皮膚科20例扁平苔蘚患者皮損，男13例，女7例，年齡41~73歲，平均39.4歲均經臨床和病理共同確診，同時半年內未使用過糖皮質激素和那樣抑制劑類藥物。健康對照組20例，取自整形科健康人皮膚，男11例，女9例，年齡32~67歲，平均36.8歲。兩組性別和差異無統計學意義。所有組織均制成石蠟標本備用。 

    二、試劑 
    兔抗人TNF- 多克隆抗體、兔抗人Caspase-8多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；即用型二步法檢測試劑盒PV-9000（美國GBI公司），二氨基聯苯胺（DAB）試劑（美國Sigma公司）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）。 

    三、 方法 
    1、免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水化；3% 溶液消除內源性過氧化物酶活性。分
別滴加TNF- 、Caspase-8和Caspase-3多抗（滴度分別為1:150,、1:250和1:100），TNF- 、Caspase-8采用已知陽性乳腺癌組織作陽性對照；Caspase-3采用正常扁桃體作陽性對照；磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，再滴加二步法試劑PV-9000。以上各步驟均采用PBS沖洗5min共3次。DAB顯色，蘇木素復染、脫水封片。

    2、凋亡檢測法：石蠟切片脫蠟至水化，過0.3% 甲醇。滴加蛋白酶K工作液，37 孵育30min；滴加新鮮配置的TUNEL反應液，37 孵育60min，以只含標記dUNEL反應液作陰性對照；加過氧化物酶轉化劑（POD），37 孵育30min。以上各步驟均采用PBS沖洗5min共3次。DAB顯色，蘇木素復染，脫水封片。 
    3、結果判斷：免疫組化結果以胞質或胞核著棕黃色為陽性細胞，采用MIAS-2000圖像分析系統進行定量分析，用積分廣密度值（integrated optical density,IOD）代表每張切片的陽性表達強度，每張切片隨機測定5個高倍視野（×400），取平均值，用 ±s表示。凋亡檢測結果以胞核著棕黃色為凋亡細胞百分比，取平均值為最終凋亡指數（apoptosis index,AI），用 ±s表示。 
    4、統計學分析：采用SPSS11.5統計軟件分析，組間比較采用成組t檢驗。指標間相關性采用Pearson相關分析，以 =0.05為檢驗水準。 

    結果 
    一、 免疫組化結果 
    TNF- 、Caspase-8陽性染色定位于胞質，Caspase-3陽性染色定位于胞質或胞核。扁平苔蘚組TNF- 、Caspase-8和Caspase-3陽性細胞主要位于表皮基底層和棘層，表達慢性增強，真皮淺層淡性細胞也有少量表達；健康對照組三者僅在部分標本的基底層偌陽性表達。兩組間IOD均值比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。 

    二、凋亡檢測結果
扁平苔蘚組表皮和真皮淺層散在分布凋亡細胞，主要位于基底層和棘層，特別是基底液化區域更集中，部分表皮全層均可見大量凋亡細胞；健康對照組僅顆粒層有少量凋亡細胞。扁平苔蘚組AI值明顯高于健 康對照組，差異均有統計學意義（P<0.01）。 

    三、相關性分析 
    扁平苔蘚患者TNF- 、Caspase-8的表達強度與其角質形成細胞的凋亡指數間均呈正相關，r分別為0.72、0.75，P值均<0.01；同時兩者與Caspase-3的陽性表達也均呈正相關r分別為0.78、0.73，P值均<0.01。 

    討論 
    扁平苔蘚是一種原因不明確的累及皮膚黏膜的炎性丘疹鱗屑性疾病，其發生與細胞凋亡有關。我們運用TUNEL法檢測扁平苔蘚皮損中細胞的凋亡情況，發現扁平苔蘚皮損中角質形成的細胞凋亡明顯增多，與文獻報道結果完全一致，且凋亡主要其中于表皮基底層和棘層，在基底液化區域尤為明顯，故推測細胞細胞過渡凋亡可能在促進皮損處基底細胞液化變化中啟到一定的作用。細胞凋亡時，DNA斷裂早于DNA含量和細胞形成的改變，而TUNEL法正是以檢測凋亡細胞的DNA斷裂點來判斷細胞凋亡，所以此法可以檢測到處于凋亡早期的細胞，所以在部分扁平苔蘚表皮各層發現有大量凋亡細胞。 

    Caspase分子的級聯反應在凋亡過程中起著重要的介導作用，其中Caspase-3是凋亡反應中重要的執行者，無論是死亡受體途徑還是線粒體途徑都需要激活Caspase-3才能引發凋亡，所以Caspase-3常被作為判斷凋亡的指標。本研究顯示，扁平苔蘚中Caspase-3陽性細胞主要分布于表皮，間接提示表皮細胞凋亡過度，與TUNEL檢測的凋亡結果基本吻合。
TNF- 在體內人來源廣泛，與其受體TNFRI結合，通過活化一系列信號傳導因子，激活Caspase-8、3等分子，來引起靶細胞凋亡，其中Caspase-8是凋亡反應中是最重要的啟動者，不僅參與死亡受體途徑，也可以啟動線粒體途徑，進一步放大凋亡信號。 

    扁平苔蘚表皮中TNFRI表達上調，靠近基底層表達水平更高。本實驗顯示，扁平苔蘚皮損中TNF- 和Caspase-8表達上調，強度一致，TNF- 表達情況與丁政云等的報道結果吻合。我們還發現，兩者表達強度均與皮損中角質形成細胞凋亡指數和Caspase-3的表達呈正相關，且二者陽性細胞和凋亡細胞都是主要位于表皮基底層和棘層，提示扁平苔蘚中角質形成細胞和淋巴細胞產生的TNF- 與角質形成細胞表面的TNFRI結合，通過激活角質形成細胞中Caspase分子級聯反應引起其凋亡。另外TNF- 還可以誘導淋巴細胞向真皮淺層大量浸潤，加重了炎癥反應，促進病情發展，如阻止TNF- 釋放，抑制其活性，可能成為治療扁平苔蘚的新靶點。
（王娟，白莉，扁平苔蘚皮損中腫瘤壞死因子 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表達[J] 中安皮膚科雜志2012年12月第45卷第12期）

TAG：扁平苔蘚 皮損