神經(jīng)生長因子抗腫瘤體外實(shí)驗(yàn)研究

 

目的:探討蛇毒神經(jīng)生長因子(NGF) 對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

 

方法:采用噻唑藍(lán)(MTT) 法、臺(tái)盼藍(lán)拒染法和集落形成作為觀察指標(biāo),以NGF 5 ,10 ,15 ,20μg / ml 處理4 種人腫瘤細(xì)胞(人白血病細(xì)胞株K 562、人胰癌細(xì)胞株JF 305 ,人肺癌細(xì)胞株AGZY283a 和人胃癌細(xì)胞株MG2803) ,選用不同作用時(shí)間,分別觀察NGF 對(duì)上述細(xì)胞的影響。阿霉素(Adr) 為陽性對(duì)照藥。

 

結(jié)果:NGF 對(duì)4 種人腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞毒性作用,K562 和JF 305 比后兩者顯示出更好的量效關(guān)系( P 均< 0. 05) 。NGF 處理24 ,48 和96 h 后K 562 和JF 305 細(xì)胞的生長均受到抑制( P < 0.05 , P < 0. 01) 。并有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。處理JF 305 細(xì)胞24 ,48 和96 h ,NGF 的半抑制濃度( IC50) ,時(shí)間2效應(yīng)關(guān)系亦明顯;NGF 對(duì)K562 細(xì)胞的生長抑制作用以48 h 為顯著。NGF 還可顯著抑制JF 305 細(xì)胞的集落形成,并有明顯的量效關(guān)系( P < 0. 01) ,其IC50為12. 86μg/ ml 。

結(jié)論:NGF 對(duì)4 種人腫瘤細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性和生長抑制作用,對(duì)K562、JF 305 作用更顯著。

 

 

【Abstract】　Objective : To observe the inhibitory effects of nerve growth factor(NGF) on human tumor cell lines. Meth2

ods :The MTT colorimetric method , trypan blue exclusion ,and colony formation was used. Adr used as positive control. Four kinds

of human tumor cell lines , K562 ,JF 305 , AGZY283a and MG2803 were treated with NGF at different final concentrations of 5 ,

10 ,15 , and 20μg/ ml. The effects of NGF on the cells mentioned above were observed at different intervals after the cell were ex2

posed to NGF.

Results :NGF had obvious cytotoxicity on these cell lines. There were obvious dose2response relationship in test of

K562 and JF 305 cells ( P < 0. 05) . K 562 and JF 305 were exposed to NGF at different intervals of 24 ,48 , and 96 h , the

growth of both cell lines was inhibited obviously and the dose2response relationships were showed distinctively. At 24 , 48 , and 96

h intervals after JF 305 cells were exposed to NGF ,there was obvious time2reponse relationship. The inhibitory effect of NGF on

the growth of K562 reached peak at 48h time point. NGF also possessed inhibitory effect on colony formation of JF 305 cells with

satisfied dose2response relationship ( P < 0. 01) and the IC50 was 12. 83μg/ ml. Conclusion :NGF possesses distinct cytotoxicity

and growth inhibitory effect on the four kind of human tumor cells especially on K562 and JF 3051

 

 

　　腫瘤是危害人類健康的嚴(yán)重疾病,近年來,利用我國動(dòng)物資源開發(fā)新的抗腫瘤藥物,成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。蛇毒神經(jīng)生長因子(nerve growthfactor , NGF) 抑瘤作用,國內(nèi)尚未見報(bào)道。我們觀察蛇毒抗腫瘤有效成分對(duì)4 種人腫瘤細(xì)胞的作用,報(bào)告如下。

1 　材料與方法

111 　材料

11111 　細(xì)胞:人白血病細(xì)胞株K 562 ,人胰癌細(xì)胞株JF 305 , 人肺癌細(xì)胞株AGZY283a ,人胃癌細(xì)胞株MG2803。除K 562 細(xì)胞為懸浮生長,其余3 種細(xì)胞均貼壁生長,培養(yǎng)于含5 %胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中(內(nèi)含青霉素100 u/ ml ,鏈霉素100 u/ ml) 。細(xì)胞在含5 % CO2 的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d 傳一代,細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

11112 　藥品與試劑:NGF 的分離采用常規(guī)層析方法進(jìn)行分離,高效液相色譜(HPLC) 法分析檢測蛇毒的分離效果,經(jīng)冷凍干燥后- 30 ℃保存,實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水稀釋成所需濃度。鹽酸阿霉素(adriamycin ,Adr)為意大利普強(qiáng)公司生產(chǎn)市售凍干粉劑,使用前用RPMI 1640 稀釋。

11113 　細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn):采用噻唑藍(lán)(MTT) 法[1 ] 。貼壁生長的腫瘤細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后,制成含細(xì)胞1.0 ×105/ ml 單細(xì)胞懸液,分別接種于無菌96 孔培養(yǎng)板中,每孔反應(yīng)總體積200μl ,設(shè)空白對(duì)照組(加等體積RPMI 1640) 、陽性對(duì)照和NGF 組,每組4 個(gè)重復(fù)孔。NGF 處理MG2803、AGZY283a 、JF 305 和K 562細(xì)胞時(shí)選用4 個(gè)濃度5 ,10 ,15 ,20 μg/ ml ,Adr (0. 25μg/ ml) 為陽性對(duì)照,細(xì)胞置37 ℃培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h 加入MTT 20μl (5 mg/ ml) 繼續(xù)培養(yǎng)4 h ,棄上清液,加入二甲基亞砜(DMSO) 100μl/ 孔,用酶標(biāo)儀于波長570 nm 處測定A570值,按下列公式求出生長抑制率( IR) :IR( %) = (1 - 用藥組A570值/ 對(duì)照組A570值) ×100

11114 　生長抑制實(shí)驗(yàn):采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法。4 種腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及給藥濃度同細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。NGF處理細(xì)胞24 ,48 ,96 h 計(jì)數(shù)拒染活細(xì)胞數(shù),計(jì)算IR 和半抑制濃度( IC50) 。

11115 　集落形成實(shí)驗(yàn):按文獻(xiàn)[ 2 ]方法取JF 305 細(xì)胞每孔1 ml (600 cells/ ml) ,接種于12 孔板,每孔再加入1ml 培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)分組及給藥濃度同細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。于37 ℃,5 % CO2 溫箱中靜置培養(yǎng)24 h 后,各組加入相應(yīng)藥物,培養(yǎng)4 h ,用D2Hank 液洗3 遍,更換新鮮培養(yǎng)液(2 ml/ 孔) 靜置培養(yǎng)7～10 d。在×20 解剖鏡下計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上的集落,計(jì)算集落形成抑制率( IR) 及IC50 。

112 　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　OD 值采用F 檢驗(yàn)和q 檢驗(yàn),集落形成采用χ2 檢驗(yàn),將細(xì)胞數(shù)與OD 值、劑量效應(yīng)做直線回歸與相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)用t 檢驗(yàn)。

2 　結(jié)果

211 　NGF 對(duì)人腫瘤細(xì)胞的毒性作用　NGF 處理4種腫瘤細(xì)胞后,細(xì)胞代謝MTT 的能力下降,細(xì)胞毒性反應(yīng)明顯。其對(duì)AGZY283a 、MG2803 細(xì)胞毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯,NGF 對(duì)K 562 ,JF 05 兩種細(xì)胞顯示出更好的劑量效應(yīng)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r 分別為0. 9726 和0. 9768 ( P 均< 0. 05) , IC50分別為12. 64μg/ ml 和12. 68μg/ ml ,見表1。

 

 

212 　NGF 對(duì)人腫瘤細(xì)胞生長抑制作用　K 562 ,JF305 細(xì)胞經(jīng)NGF 處理24 ,48 ,96 h 后,生長明顯受抑制,劑量效應(yīng)關(guān)系顯著,相關(guān)系數(shù)r 在24 ,48 和96 h分別為0. 9823 ,0. 9726 ,0. 9789 和0. 9769 ,0. 9836 ,0.9806 ( P均< 0. 05) 。IC50分別為17. 89 ,10. 60 ,13. 42μg/ ml 和18. 25 ,4. 36 ,9. 10μg/ ml 。對(duì)K 562 細(xì)胞的生長抑制作用以48 h 為顯著,96 h 時(shí)效應(yīng)不增強(qiáng),JF305 細(xì)胞生長抑制效應(yīng)隨NGF 作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。見表2(略)。

2. 3 　NGF 對(duì)JF 305 細(xì)胞集落形成抑制作用　NGF濃度> 10μg/ ml 時(shí),JF 305 細(xì)胞的集落的形成能力明顯降低( P < 0. 01) 。IR 隨NGF 濃度的增高而升高,直線回歸方程為Y = - 0. 026 + 0. 046 X ( r =0. 9808 , P < 0. 05) ,劑量效應(yīng)關(guān)系顯著,IC50為12. 86μg/ ml 。見表3(略)。

 

 

3 　討論

在抗腫瘤藥物篩選和研究中,體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)居重要地位[2 ] 。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法篩選抗腫瘤藥物時(shí),檢測的終點(diǎn)指標(biāo)包括細(xì)胞的生存能力和生長能力檢測兩個(gè)方面,前者的檢測常采用MTT 法,后者的檢測常采用集落形成能力實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)或其它大分子物質(zhì)含量測定等。兩者結(jié)合能客觀地反應(yīng)被測物質(zhì)的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用4 種人腫瘤細(xì)胞系采用體外培養(yǎng)的方法,全面觀察NGF 的抗腫瘤作用。國外已報(bào)道NGF對(duì)一些神經(jīng)和非神經(jīng)腫瘤,如前列腺癌、肺癌、乳腺癌的抗腫瘤作用。結(jié)果顯示NGF 可發(fā)揮抑制有絲分裂和生長作用(依賴于細(xì)胞類型) 。例如NGF 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長和侵入,而在人類小細(xì)胞癌,NGF 可抑制癌細(xì)胞的增殖,阻止它們的克隆生長,在體外可削弱它們的入侵能力,在裸鼠則消除其腫瘤生長能力[3～6 ] ,有報(bào)道認(rèn)為,NGF 可以抑制一些胰癌細(xì)胞系的入侵[7 ] 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NGF 在所用劑量范圍內(nèi)(5～20μg/ ml) 對(duì)MG2803 ,AGZY283a 、JF 305、K 562細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用,細(xì)胞經(jīng)NGF 處理后活細(xì)胞數(shù)減少,代謝MTT的能力下降,細(xì)胞生長受到抑制,克隆形成能力下降。并顯示與NGF 的濃度和作用時(shí)間均有依賴性,說明NGF 具有一定的抗腫瘤作用。

 

[1 ] Carmichael J . Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colori2metric assay : assessment of radiosensitivity[J ] . Cancer Res , 1987 , 47(4) : 943 - 946.

[2 ] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival :application to proliferation and cytotoxicity assays[J ] . J Immunol Meth2ods , 1983 , 65 (8) : 35 - 38.

[3 ] Geldof , AA , De Kleijn MA , Rao BR ,et al . Nerve growth factor stimu2lates in vitro invasive capacity of DU145 human prostatic cancer cells[J ] . Cancer Res Clin Oncol , 1997 , 123 (2) : 107 - 112.

[4 ] Descamps S , Lebourhis X, Delehedde M,et al . Nerve growth factor ismitogenic for cancerous but not normal human breast epithelial cells[J ] .Biol Chem, 1998 , 273(27) : 16659 - 16662.

[5 ] Oelmann E , Sreter L , Schuller I ,et al . Nerve growth factor stimulatesclonal growth of human lung cancer cell lines and a human glioblastomacell line expressing high2affinity nerve growth factor binding sites involv2ing tyrosine kinase signaling[J ] . Cancer Res , 1995 , 55 (10) : 2212 -2219.

[6 ] Miknyoczki SJ , Lang D , Huang L ,et al . Neurotrophins and Trk recep2tors in human pancreatic ductal adenocarcinoma : expression patterns andeffects on in vitro invasive behavior[J ] . Int Cancer , 1999 , 81 (3) : 417- 427.

[7 ] Miknyoczki SJ , Chang H , Klein2Szanto A ,et al . The Trk tyrosine ki2nase inhibitor CEP2701 (KT25555) human pancreatic ductal adenocarci2noma[J ] . Clin Cancer Res , 1999 , 5(8) : 2205 - 2212.