許　波,楊　軍　　(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院口腔科,重慶400038)

 

　　三叉神經(jīng)損傷臨床較為常見,本研究通過建立動(dòng)物模型,探討外源性NGF 對(duì)三叉神經(jīng)下頜支損傷后感覺神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)因子Bcl22 及Bax 的影響,以期尋求一種更為理想的周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)方法提供理論依據(jù)。

 

1. 1 　動(dòng)物分組及模型建立

　　健康雄性成年Wistar 大鼠120 只,體重250～300 g(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) 。分為三大組,每組6 只,正常對(duì)照組, 左側(cè)三叉神經(jīng)下頜支離斷后單純吻合組,左側(cè)三叉神經(jīng)下頜支離斷后吻合+ NGF 組(NGF組) 。

　　大鼠經(jīng)1 %戊巴比妥鈉(50～60 mg/ kg) 腹腔注射麻醉后,備皮、消毒,切開左側(cè)下頜下緣皮膚、肌肉,骨膜,掀起頰側(cè)軟組織瓣,顯露下頜骨,找出下齒槽神經(jīng)血管束。去除下頜骨下1/ 3頰側(cè)骨板,顯露下齒槽神經(jīng)血管。在手術(shù)顯微鏡下,仔細(xì)分離下齒槽神經(jīng)。自頦孔向后約6 mm 處切去下齒槽神經(jīng)6 mm ,任其回縮。神經(jīng)離斷后0、3、7 d 用14 mm長的硅膠管(內(nèi)徑115mm ,外徑210 mm) 橋接,9 個(gè)0 無損傷尼龍線穿過神經(jīng)斷端外膜,兩端分別套入管內(nèi)2 mm并固定于管壁上,對(duì)左側(cè)下齒槽神經(jīng)造成10 mm缺損。同時(shí)管內(nèi)注射NGF(中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供) 溶液(1 mg/ L) 30μl 或等量的生理鹽水。術(shù)后分別飼養(yǎng)15 d ,30 d。各組動(dòng)物飼養(yǎng)至所需時(shí)間后用4 %的多聚甲醛灌注取材。

1. 2 　取材、固定、初步處理及切片

　　方法參照文獻(xiàn)[1 ] ,取材于三叉N 感覺核區(qū),沿大腦腳蓋中部靠外側(cè)(前囟后9168 mm ,中線旁0168 mm) ,行冰凍冠狀連續(xù)切片(10μm) ,切片置于- 20 ℃冰箱中保存以備用。

1. 3 　觀察方法

1. 3. 1 　原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxycleotidy12transferase2medi2ated dUTP2biotin nick end labeling TUNEL) 標(biāo)記凋亡細(xì)胞　　

TUNEL 法試劑盒購至博士德公司(MK 1 020) ,操作參照說明書進(jìn)行,在×100 普通光鏡下觀察感覺核區(qū)內(nèi)TUNEL 陽性細(xì)胞形態(tài)。

1. 3. 2 　免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)因子Bcl22 及Bax 　　免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測試劑盒購至博士德公司(MK 1 102) ,操作參照說明書進(jìn)行,在×100 倍普通光鏡下觀察感覺核區(qū)內(nèi)Bcl22、Bax 表達(dá)。

1. 3. 3 　圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　　取各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)相點(diǎn)感覺核區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),比較各組TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量以及Bcl22、Bax 表達(dá)量的差異。數(shù)據(jù)采用方差分析。

 

2. 1 　NGF 對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)量的影響

　　凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)TUNEL 法染色胞核呈黃褐色,從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒,胞質(zhì)不著色者為陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞) 。軟件圖像灰度比分析結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經(jīng)元凋亡數(shù)都明顯增加,但0 d、3 d 吻合的NGF 組凋亡數(shù)明顯少于單純吻合組( P < 0101) ,而7 d 吻合NGF 組細(xì)胞凋亡數(shù)與單純吻合組無明顯差異( P > 0105) 。

2. 2 　NGF 對(duì)Bcl22 及Bax 的影響

　　免疫細(xì)胞化學(xué)顯示,Bcl22 及Bax 在正常成年大鼠三叉神經(jīng)感覺神經(jīng)元中表達(dá)很低,僅見少量免疫反應(yīng)可疑陽性細(xì)胞,細(xì)胞著色很淡。與正常對(duì)照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經(jīng)元細(xì)胞Bcl22 及Bax 的表達(dá)不同程度地增高,NGF 組中Bcl22的表達(dá)明顯高于單純吻合組( P < 0101) 而單純吻合組中Bax 的表達(dá)明顯高于NGF 組( P < 0101) 。

 

　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)元變性和壞死可引起軸突再生的失敗,這可能與損傷引起的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子(NGF) 與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系十分密切[2 ] ,其生物學(xué)作用不僅表現(xiàn)在可阻止神經(jīng)元發(fā)育過程中凋亡的發(fā)生,同時(shí)對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的連接也有重要的作用。但是關(guān)于NGF 對(duì)三叉神經(jīng)損傷后感覺神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡是否具有抑制作用目前尚未見報(bào)道。

　　本研究發(fā)現(xiàn)NGF 可以抑制損傷后三叉神經(jīng)感覺核神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,結(jié)果同時(shí)顯示,7 d 吻合加NGF 組與單純吻合組的神經(jīng)元凋亡數(shù)無明顯差異,提示神經(jīng)損傷后盡快恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性及軸漿運(yùn)輸通道是十分必要的。

　　人們?cè)诘蛲龅姆肿由�物學(xué)研究中還發(fā)現(xiàn),凋亡與胞核內(nèi)某些基因有關(guān),Bcl22 家族是研究較早的與凋亡有關(guān)的基因。B 細(xì)胞淋巴瘤/ 白血病22 (B2cell lymphoma/ leukemia22 , Bcl22) 中有的稱為抑凋亡基因,如Bcl22 ;有的則稱為促凋亡基因,如Bax。這些基因家族成員自身或彼此之間形成二聚體/ 多聚體。Bcl22家族的蛋白2蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的存活與凋亡,核心是Bcl22 與Bax 的相互作用[3 ] 。有實(shí)驗(yàn)表明[4 ] ,在節(jié)狀神經(jīng)元中Bcl22 的抗凋亡效應(yīng)完全依賴Bax 的存在;而在三叉神經(jīng)元中Bcl22 的抗凋亡效應(yīng)并不依賴Bax 的存在,從而說明Bcl22 的抗凋亡效應(yīng)或是通過抑制其他促凋亡蛋白來發(fā)揮或是由Bcl22 直接抑制死亡效應(yīng)蛋白所致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三叉神經(jīng)損傷后,局部給予外源性NGF 可使抗凋亡基因Bcl22 和促凋亡基因Bax均增加,但Bcl22 更加顯著,這樣Bcl22 與Bax 的相對(duì)比例增加,從而抑制凋亡,這與有的學(xué)者研究結(jié)果一致。

　　綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三叉神經(jīng)下頜支損傷后,在盡早恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性的同時(shí)局部早期予以外源性NGF ,可更加明顯地減少神經(jīng)元的凋亡,有效地促進(jìn)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。但目前關(guān)于NGF 調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全闡明,還有許多未知調(diào)控因素以及相關(guān)基因?qū)��?xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

 

 

參考文獻(xiàn):

[1 ] 蔡文琴,王伯氵云主編. 實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)[M] . 成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,1992. 128.

[ 2 ] Derby A , Engleman V W, Frierdich G E , et al . Nerve growth factor facili2tates regeneration across nerve gaps : morphological and behavioral studies inrat sciatic nerve[J ] . Exp Neurol ,1993 ,119 (11) :176 - 191.

[3 ] Merry E , Korsmeyer SJ . Bcl22 gene family in the nervous system[J ] . An2nu Rev Neurosci ,1997 ,20 (3) :245 - 257.

[4 ] LindenboimL , Yuan J , Stein R. Bcl2xS and Bax induce different apoptoticpathways in PC12 cells[J ] . Oncogene ,2000 ,19(14) :1 783 - 1 793.

(編輯　陳聰連)